在对间变性大细胞淋巴瘤的研究中,研究者首次发现了间变性淋巴瘤激酶(Anaplastic lymphoma kinase,ALK)的存在。它是一种酪氨酸激酶受体(Receptor tyrosine kinase,RTKs)。由于染色体倒位的发生,ALK基因能够与棘皮动物微管相关类蛋白4(Echinoderm microtubule-associated protein-like 4,EML4)基因发生融合,形成EML4-ALK融合基因。ALK基因通过借助EML4的启动子,使ALK激酶活化,导致细胞发生癌变,促进癌症的发生和发展。目前研究发现,包括肺癌在内的多种实体瘤中均可检测到EML4-ALK融合基因的存在,其中,在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中的检出率最高,并且该类患者具有鲜明的临床特征,提示该靶点是肺腺癌特异性较高的分子标记物。目前,至少发现了14种EML4-ALK的变异体类型,所有这些融合基因的表达产物为一种嵌合型酪氨酸激酶,具有激酶活性,可激活ALK蛋白的胞内催化区域,激活相关信号通路,促进细胞增殖、存活、迁移,从而达到细胞癌变的效果。因此,快速、准确和及早地检测EML4-ALK融合基因对肺癌的早期检测、分子分型和靶向治疗至关重要。目前,所有EML4-ALK融合基因的检测方法都是针对手术或者活检取材后的肿瘤组织进行的,无法实现早期检测和实时监测,且由于肿瘤异质性问题,使得患者的检测结果可能出现假阴性。近年来,液态活检为肿瘤的检测提供新的思路,能够有效的避免组织活检的局限性。外泌体是液态活检主要检测的物质之一。它的形成过程:首先是由细胞通过内吞作用形成早期内体,而后早期内体经过内陷发展为多囊泡内体,当多囊泡内体转移至细胞膜附近时,其与细胞膜发生融合,从而导致原本存在于多囊泡内体中的囊泡释放到细胞外,通过这种方式分泌到胞外的囊泡称为外泌体。由于外泌体特殊的形成过程,使得其中含有能够反映分泌细胞生理状态的蛋白质、DNA和microRNA等信号分子,可能包含了细胞病变相关的信息。这一点使外泌体成为能够提供丰富的潜在生物标志物分子源的靶标。疾病的不同,病变细胞所分泌到胞外的外泌体中含有的特定成分不同。这使得从体液(包括血液、尿液、胸腹水等)中分离纯化外泌体,再对其组成及信号分子进行分析成为可能,有望应用于疾病诊断及监测,尤其在肿瘤标志物检测方面。因此,外泌体极有可能在一定条件下代替组织活检,成为一种新型无创的疾病检测靶标,并且可以获得疾病早期发展的相关信息。目前,关于外泌体中信号分子的报道有:来源于肿瘤细胞的蛋白质、双链DNA、microRNA等。但外泌体中是否含有融合基因的mRNA还尚未报道。目前具有该融合基因的细胞系有三种,分别为H3122、H2228以及DFCI032细胞。选取H3122细胞、H2228细胞以及不具有EML4-ALK融合基因的A549细胞作为阴性对照进行试验,对使用外泌体检测融合基因mRNA的可行性进行初步验证。首先在NCBI上查找EML4和ALK的基因序列,并针对这两种基因的几种不同融合形式分别设计引物。提取H3122、A549细胞的RNA进行逆转录PCR,测序结果证实H3122细胞发生融合的位点在EML4的第13外显子与ALK的第20外显子发生融合,即为V1融合形式。同时,提取这两种细胞的蛋白质进行Western Blot实验以检测ALK蛋白的表达情况。Western Blot实验结果显示,H3122细胞在120kD处有一条特异性条带,通过对EML4-ALK融合蛋白大小进行分析,发现其与V1形式的融合蛋白大小相符。将H3122、A549细胞饥饿处理24-48小时后,收集细胞培养上清,提取细胞培养上清中的外泌体。通过电镜形态学观察以及外泌体特异性表面膜蛋白的分析,证实外泌体提取成功。提取外泌体中的RNA,进行RT-PCR,在H3122细胞培养上清外泌体可以成功扩增到EML4-ALK融合基因,测序结果证实其融合形式也是V1,与H3122细胞中的融合形式是一致的。对H2228细胞使用相同的实验方法检测EML4-ALK融合基因及其融合形式,测序结果证实其融合形式为V3a(融合位点为EML4基因的第6外显子与ALK基因的第20外显子发生融合)和V3b(融合位点为EML4基因的第6外显子加上33bp内含子与ALK基因的第20外显子发生融合),在H2228细胞培养上清外泌体中也可以检测到EML4-ALK融合基因,其融合形式与细胞的融合形式是一致的。除了对肺癌细胞H3122和H2228进行检测,还检测了具有BCR-ABL融合基因的慢性白血病细胞K562,在其外泌体中也可以成功检测到BCR-ABL融合基因。通过对以上三种细胞的研究,证实融合基因的mRNA通过外泌体由胞内分泌到胞外是一种普遍现象,这一点为使用外泌体作为靶标进行临床检测奠定了基础。通过RT-PCR、IHC和Western Blot对89例NSCLC患者的肿瘤组织的EML4-ALK融合基因进行了检测,共筛选出15例具有融合基因的患者,其中V1融合形式5例,V2融合形式1例,V3融合形式8例和V5融合形式1例。收集这15例组织学检测为阳性患者的血清,分离提取血清中的外泌体,利用RT-PCR方法,对这15例患者的血清外泌体进行了EML4-ALK融合基因的检测。其中14例患者的血清外泌体中检测到EML4-ALK融合基因的存在,并且通过分析,发现血清外泌体中检测到的融合基因的融合形式与相应肿瘤组织中检测到的融合形式是一致的。而在组织学检测为阴性的74名患者中,同样以外泌体为靶标,进行融合基因的检测,检测到4例阳性患者。对这4例患者进一步扩大组织学检查范围,IHC结果显示为ALK阳性。该试验说明利用血清外泌体进行的检测不仅是无创的,而且还能够克服肿瘤异质性问题,提高了对EML4-ALK融合基因检测的准确度。由于这89名患者均属于癌症晚期病人,对这些血清标本进行早期诊断的研究,没有实际意义。因此,拟通过建立肺癌细胞裸鼠荷瘤模型,研究以外泌体为靶标进行肿瘤早期诊断的的可能性。将状态良好的H3122细胞、H2228细胞和A549细胞分别接种于4-6周龄的雌性裸鼠背部皮下,接种的细胞量为每只裸鼠接种1×106个细胞。接种后,定期测量裸鼠背部的肿瘤体积。H3122、H2228实验组每次每组取4只小鼠,A549对照组每组取1只进行眼球取血,分离血清外泌体,进行EML-ALK融合基因检测。实验结果显示,接种H3122细胞的裸鼠,在接种后的第4天才能够测量肿瘤体积的大小,但是在接种后的第2天,就可以在其血清外泌体中检测到EML4-ALK融合基因的存在。接种H2228细胞的裸鼠,在肿瘤形成的早期也可以在血清外泌体中检测到EML4-ALK融合基因的存在。裸鼠荷瘤的试验为以血清外泌体为靶标,对EML4-ALK融合基因早期检测的相关研究提供了一定的实验基础。综上所述,本课题首次证实外泌体中存在来源于肿瘤细胞的融合基因mRNA;肿瘤患者的血清外泌体可以检测到EML4-ALK融合基因,并且这种检测不仅可以做到对融合基因的确认,还可以确定融合类型。本课题为利用血清外泌体检测融合基因这一新的检测方法的建立以及靶向药的使用提供了一定的实验室参考依据。