引言冠状动脉粥样硬化性心脏病（coronary heart disease，CHD，简称冠心病）是由多种遗传因素与环境因素共同作用所致的以冠状动脉粥样硬化性改变为病理特征的一种疾病。遗传学因素在其发生发展过程中扮演重要角色。自2001年发现载脂蛋白A5（Apolipoprotein A5，ApoA5）基因以来，其单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNP）与冠心病的关系开始受到关注。载脂蛋白位于脂蛋白表面，负责把脂蛋白运输到身体各部位。它们以多种形式和不同比例存在于各类脂蛋白中。现已发现的载脂蛋白有近20种之多。载脂蛋白A5是Pennacchio等[1]2001年发现的一个最新的血浆载脂蛋白家族成员。他们通过生物信息学技术与抑制消减杂交技术在对人与小鼠的ApoA1／C3／A4基因簇序列进行比较时发现了ApoA5基因的存在。它位于第11号染色体q23区，距ApoA1／C3／A4基因簇下游约30kb，全长1889bp，由4个外显子和3个内含子组成，其表达产物含有366个氨基酸，切除信号肽后的成熟蛋白产物含有343个氨基酸，因与相邻基因ApoA4高度相似而得名为ApoA5。据动物实验和人类基因组ApoA5基因研究，其基因多态性对血浆甘油三酯水平有明显的影响，是第一个过度表达引起血浆甘油三酯水平下降的载脂蛋白[1]。因此，ApoA5基因多态性与甘油三酯及冠心病的关系成为当前的研究热点之一。Pennacchio等[1]通过对高加索人apoa5基因多态性进行分析，发现了4个常见的突变位点1259T＞C、476G＞A、-1131T＞C和-12238T＞C，分别命名为SNP1、SNP2、SNP3、SNP4。随后又发现了-3A＞G、56C＞G等单核苷酸多态性。经染色体分析发现，上述SNP之间存在连锁不平衡，形成3种常见的单倍体型ApoA5*1{-1131T、-3A、56C、476G、1259T}，ApoA5*2{以-1131C为标志}，ApoA5*3{以566为标志}。其中ApoA5*1是野生型，ApoA5*2、3与血清高甘油三酯有关[2]。继之又有关于553G＞T等多态性位点的报道。目前NCBI已收录20多个SXP位点。本研究拟检测ApoA5基因多态性在中国浙江地区汉族人群中的分布，并对其与血脂及冠心病发病关系进行探讨。对象与方法一、研究对象冠心病组：选自2005年浙江大学医学院附属第二医院心内科住院病人，符合世界卫生组织（WHO）关于缺血性心脏病的命名及诊断标准，所有患者经选择性冠状动脉造影证实，造影结果由2位有经验的介入医生进行评估，左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉中至少有1支内径狭窄≥50％)。对照组：选自同期该院心内科冠状动脉造影阴性人群。本研究对象均为浙江地区汉族人群，个体之间无血缘关系。二、冠状动脉病变支数的评价冠状动脉造影时，分别对右冠状动脉、左冠状动脉前降支、左旋支和左主干阻塞病变程度进行评价。各主要分支存在＞50％狭窄定义为有意义病变，并根据有意义病变累及支数定义为单支、双支与三支病变，累及左主干者计作两支病变。三、冠心病危险因子调查设计冠状动脉粥样硬化登记调查表，详细记录每一患者的临床表现，辅助检查，化验检查结果及危险因素。冠心病经典危险因子按下述标准定义：高血压：采用1999年世界卫生组织和国际高血压学会（WHO／ISH）的标准定义和诊断。糖尿病：符合1997年美国糖尿病学会（ADA）糖尿病诊断标准。高脂血症：根据1997年血脂异常防治建议，血清总胆固醇（TC）≥220mg／dl或／和甘油三酯（TG）≥150mg／dl或／和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）≥140mg／dl和／或高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）≤35mg／dl。吸烟：包括目前吸烟者和既往吸烟现已戒烟者。四、基因组DNA抽提和ApoA5基因多态性检测1．白细胞基因组DNA抽提：取空腹外周血2ml，EDTA钠抗凝；2000rpm离心分离血浆和细胞成分，采用低渗溶血法获得白细胞，以酚／氯仿法提取白细胞DNA，TE溶解，-80℃保存。2．ApoA5 -1131T＞C位点基因型分析：PCR扩增目的基因。根据Pennacchio等[1]的方法设计引物序列：上游引物5’-GATTGATTCAAGATGCATTTAGGAC-3’；下游引物5’-CCCCAGGAACTGGAGCGAAATT-3’。PCR反应体系共25ul，其中模板DNA0.1ug，10×Reaction buffer2.5ul，25mM MgCl₂ 1.5ul，10 mM dNTP 0.5ul，上下游引物各5pmol，Tag DNA聚合酶0.25U。PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸10min。扩增得长度为187bp的目的基因片段。PCR产物放置4℃备用。-1131T＞C位点酶切反应。取PCR产物10ul，限制性内切酶TrulⅠ（MBI Fermentas公司）5U，10×buffer 2ul，加双蒸水至20ul，65℃水浴6小时，产物经2.5％琼脂糖凝胶（含溴乙锭0.5ug／ml）电泳，90V电压，60分钟后通过紫外光凝胶成像系统鉴定基因型。3．ApoA5 c.553G＞T位点基因型分析：PCR扩增目的基因。根据Jau-Tsuen Kao等[3]的方法设计引物序列：上游引物5’-AGACACCAAGGCCCAGTTGCTGGG-3’；下游引物5’-ATGCCGCTCACCAGGCTCTCGGCG-3’。PCR反应体系共25ul，其中模板DNA0.1ug，10×Reaction buffer2.5ul，25mM MgCl₂ 1.5ul，10 mM dNTP 0.5ul，上下游引物各5pmol，Tag DNA聚合酶0.25U。PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃延伸7min。扩增得长度为138bp的目的基因片段。PCR产物放置4℃备用。c.553G＞T位点酶切反应。取扩增产物10ul，限制性内切酶HaeⅢ（MBI Fermentas公司）5U，10×buffer 2ul，加双蒸水至20ul，37℃水浴过夜，产物电泳及成像方法如上。产物经3％琼脂糖凝胶（含溴乙锭0.5ug／ml）电泳，90V电压60分钟后，通过紫外光凝胶成像系统鉴定基因型。五、统计分析用冠状动脉粥样硬化登记调查表详细记录两组样本的临床表现，辅助检查及危险因素。计量资料用均数±标准差（（?）±S）表示，用t检验或单因素方差分析比较其差异的显著性水平。计数资料以频数和构成比表示，卡方检验对各组间差异进行比较。计算各组基因型及等位基因型频率，用Hardy-Weinbery平衡检验确定各组等位基因频率的群体代表性。所有数据采用SPSS11.5软件包处理。P＜0.05表示差异有统计学意义。结果一、ApoA5 -1131T＞C位点分析1．共观察270例，其中冠心病组141例，对照组129例。两组间吸烟率有差异，而年龄、性别、高血压病史率、糖尿病病史率、血脂均无统计学差异。2．两组基因型分布均具有群体代表性。冠心病组与对照组相比，三种基因型分布无统计学差异。冠心病组C等位基因频率明显高于对照组（P＜0.05）。3．-1131 TC、CC等位基因组甘油三酯水平明显高于-1131 TT基因型甘油三酯水平，具有统计学差异；总胆固醇水平-1131CC基因型明显高于TT基因型；血糖水平-1131CC基因型明显高于TC基因型。其余各组指标未发现差异。二、ApoA5 c.553G＞T位点分析1．共观察269例，其中冠心病组145例，对照组124例。两组间性别年龄、吸烟率、高血压病史率、糖尿病病史率、血脂均无统计学差异。2．两组基因型分布均具有群体代表性。冠心病组和c.553TT基因型频率高于对照组，c.553GG基因型频率低于对照组，三种基因型分布有统计学差别。冠心病组T等位基因频率显著高于对照组。3．c.553 T等位基因组甘油三酯水平明显高于非T等位基因组，具有统计学差异。而两组间总胆固醇、LDL、HDL、血糖等指标未见明显差别。4．T等位基因组与非T等位基因组，病变血管支数之间没有统计学差异。结论1．ApoA5 -1131 C等位基因与冠心病易感性有关。2．ApoA5 -1131 C等位基因与血清甘油三脂水平升高有关。3．ApoA5 c.553 T等位基因与冠心病易感性有关。4．ApoA5 c.553 T等位基因与血清甘油三酯水平升高有关。5．未发现ApoA5 c.553T等位基因与冠脉病变严重程度之间的相关性。