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呼吸道合胞病毒（Respiratory syncytial virus,RSV）是引起婴幼儿呼吸道病毒感染的重要病原体之一,特别是急性下呼吸道感染（Acute lower respiratory infection,ALRI）,是导致婴幼儿住院的重要原因。荟萃分析估计,5岁以下儿童ALRI病例中,22%归因于RSV,对RSV感染机制的研究有助于对预防及治疗方法的探索。TRIM（Tripartite motif）蛋白家族拥有80多个成员,大多具有RBCC特征性的结构域,并拥有E3泛素连接酶活性,这一特性被认为对其发挥功能有着重要的贡献。TRIM蛋白参与了众多的生命进程,其在病毒感染及自噬中的表现备受关注。实验研究表明,TRIM蛋白参与了病毒和非病毒诱导的自噬过程,TRIMs在自噬过程中起关键作用。自噬（autophagy）是真核细胞在进化上高度保守的复杂的细胞代谢过程,即将受损或多余的蛋白质、细胞器或病原体衍生物通过双膜结构吞噬,形成自噬体（autophagosomes）,并靶向溶酶体降解。自噬与肿瘤、衰老、神经退行性病变和感染等多种疾病的发生相关。多种不同病毒感染均可诱导自噬发生,自噬对病毒复制的影响结果迥然不同。本课题旨在研究TRIM蛋白在RSV感染A549细胞中的作用及可能机制,揭示RSV感染和宿主细胞博弈过程中TRIM蛋白扮演的角色,为RSV感染性疾病的防治提供理论依据。第一部分TRIM蛋白在RSV感染A549细胞的表达目的:探讨RSV感染对A549细胞TRIM蛋白表达的影响。方法:1 RSV以感染复数MOI=5感染A549细胞24 h,转录组测序检测TRIM蛋白在细胞中的表达变化。2 RSV感染A549细胞24 h,根据上一步的检测结果,选取感染组与对照组表达有差异的TRIM蛋白,以RT-q PCR验证TRIM蛋白m RNA的差异表达情况。3 RSV感染A549细胞,在0 h,6 h,12 h,24 h,36 h、48 h提取细胞总蛋白,Western blot检测TRIM22、14、21、25蛋白随时间变化的表达情况。4 RSV感染A549细胞48 h,进行免疫荧光染色,观察TRIM22在细胞中的阳性表达及定位情况。结果:1.A549细胞感染RSV转录组测序,共筛选到333个差异基因,相对于对照组,感染组中有229个基因上调,104个基因下调,筛选标准为差异倍数fold change>2,q<0.05。其中TRIM蛋白家族中有5个差异基因,为TRIM22、14、21、25和TRIM38,相对于对照组,其在感染组中均为表达上调。其中TRIM22的差异倍数最大,为3.03倍。2.将测序结果表达差异的TRIM蛋白进行RT-PCR验证,结果证实,TRIM22、14、21、25和TRIM38在A549细胞感染RSV24 h后均较非感染组显著升高（P<0.05）,与转录组测序结果基本一致。3.Western blot证实,TRIM22、14、21、25在RSV感染A549细胞36 h、48 h表达显著升高。4.免疫荧光染色证实,RSV感染A549细胞48 h后,TRIM22较对照组表达明显升高,TRIM22在胞浆中以点状和（或）斑点状散在分布。小结:1.RSV感染诱导A549细胞多种TRIM蛋白变化。2.TRIM22在RSV感染A549细胞中表达量升高最为显著。3.RSV感染A549细胞引起高表达的TRIM22定位在细胞质中,以点状和（或）斑点状散在分布。第二部分TRIM22对RSV在A549细胞中复制的影响目的:应用si RNA敲低TRIM蛋白22、14、21、25和TRIM38,了解相应TRIM蛋白对RSV在A549细胞中复制的影响,选取TRIM22进行进一步的敲低和过表达实验,明确TRIM22对RSV在A549细胞中复制的影响在A549细胞感染RSV中对RSV复制所起到的作用。方法:1应用si RNA敲低TRIM蛋白22、14、21、25和TRIM38,RT-q PCR验证A549细胞TRIMs敲低效果。2 RSV感染敲低相关TRIM蛋白的A549细胞24 h,RT-q PCR检测敲低相应TRIM蛋白对RSV N基因的影响。3应用si RNA在A549细胞敲低TRIM22,RSV感染A549细胞48 h,Western blot验证TRIM22敲低效果。4应用si RNA在A549细胞敲低TRIM22,RSV感染A549细胞24 h,RT-q PCR检测RSV的N,M,NS1,M2,G和F基因表达量的变化。5 p LV[Exp]-Puro-EF1A>{h TRIM22[NM006074.4]/3x FLAG}真核表达质粒成功构建,用该真核表达质粒转染A549细胞72 h,Western blot验证TRIM22过表达效果。6过表达TRIM22的A549细胞感染RSV48 h,RT-q PCR检测RSV的N,M,NS1,M2,G和F基因的表达量变化。7应用si RNA在A549细胞敲低TRIM22,RSV-m GFP以感染复数MOI=5感染A549细胞48 h,观察RSV-m GFP的绿色荧光在敲低TRIM22的A549细胞中的复制变化。8应用质粒转染A549细胞过表达TRIM22,RSV-m GFP感染A549细胞48 h,观察RSV-m GFP的绿色荧光在过表达TRIM22的A549细胞中的复制变化。结果:1.用相应si RNA转染A549细胞24 h,RT-q PCR实验证实,si RNA TRIM22,14,21,25和TRIM38可有效敲低A549细胞对应的TRIM蛋白m RNA表达量（P<0.05）。2.敲低TRIM 22,14,21,25和TRIM38后的A549细胞,感染RSV24 h,RT-q PCR证实,TRIM22,21和TRIM25敲低组RSV N基因的表达量低于对照组（P<0.05）,敲低TRIM14,38组RSV N基因的表达量无显著变化（P>0.05）。3.敲低TRIM22的A549细胞感染RSV48 h,Western blot证实,敲低组较对照组TRIM22表达量明显减低;4.敲低TRIM22的A549细胞感染RSV24 h,RT-q PCR实验证实,RSV的N,M,NS1,M2,G和F基因的表达量明显低于对照组（P<0.05）;5.构建p LV[Exp]-Puro-EF1A>{h TRIM22[NM006074.4]/3x FLAG}真核表达质粒,质粒转染A549细胞72 h,经Western blot证实,过表达TRIM22效果显著。6.RT-q PCR实验证实,过表达TRIM22的A549细胞感染RSV48 h,RSV的N,M,NS1,M2,G和F基因的表达量明显高于对照组（P<0.05）。7.应用RSV-m GFP感染A549细胞48 h,RSV-m GFP的绿色荧光在敲低TRIM22的A549细胞中的复制较对照组减少;RSV-m GFP的绿色荧光在过表达TRIM22的A549细胞中的复制较对照组增加。小结:1.在A549细胞中敲低TRIM22,TRIM21和TRIM25,RSV N基因的表达量下降。2.TRIM22促进了RSV在A549细胞中的复制。第三部分TRIM22通过结合自噬相关蛋白促进RSV复制目的:研究RSV感染诱导A549细胞自噬的情况,进而应用si RNA敲低TRIM22,14,21,25和TRIM38,研究相应TRIM蛋白,特别是TRIM22对RSV感染诱导细胞自噬的影响及其机制,探讨TRIM22促进RSV复制的可能机制。方法:1 RSV感染A549细胞0 h,24 h,48 h,提取细胞总蛋白,Western blot检测LC3II的表达。A549细胞经RSV感染后48 h,荧光显微镜观察LC3蛋白表达情况。2 RSV感染A549细胞0 h,24 h,48 h,提取细胞总蛋白,Western blot检测ULK1、Beclin1的表达。3 RSV感染A549细胞0 h,24 h,48 h,Western blot检测自噬流标志蛋白P62的表达;应用Baf A1（10 n M）处理细胞2 h,抑制自噬体与溶酶体融合,再用RSV感染A549细胞0 h,48 h,Western blot检测自噬流标志蛋白P62及LC3Ⅱ的表达。4应用si RNA转染A549细胞,敲低TRIM22、14、21、25、38,再用RSV感染A549细胞24 h,Western blot检测LC3II的表达。5在A549细胞中敲低TRIM22并感染RSV24 h和48 h,Western blot检测LC3II的表达;在A549细胞中敲低TRIM22并感染RSV48 h,荧光显微镜观察LC3蛋白的表达。6过表达TRIM22的A549细胞感染RSV36 h,同时设有阴性对照,全细胞裂解液经抗Flag的磁珠免疫共沉淀,通过Western blot检测ULK1、Beclin1与TRIM22的结合情况,同时检测全细胞裂解液中上述蛋白表达情况。结果:1.RSV感染A549细胞,Western blot检测LC3II的表达,结果表明在RSV感染后24 h和48 h,LC3II表达较对照明显升高,RSV感染诱导了自噬。A549细胞经RSV感染后48 h,荧光显微镜观察,LC3蛋白在A549细胞胞浆中散在分布。2.RSV感染A549细胞,Western blot检测ULK1、Beclin1的表达,结果表明在RSV感染后24 h和48 h,ULK1、Beclin1表达较对照明显升高。3.RSV感染A549细胞0 h,24 h,48 h,Western blot检测自噬流标志蛋白P62的表达,24 h时P62的表达无明显变化,48 h明显下降;应用Baf A1抑制自噬体与溶酶体融合（10 n M）,使A549细胞LC3II和P62的表达水平显著增高,提示RSV感染诱导A549细胞完全的自噬流反应。4.Western blot结果显示,敲低TRIM22、14、21后,RSV感染诱导的LC3II的表达量明显低于对照组;敲低TRIM25和TRIM38后,RSV感染诱导的LC3II的表达量较对照组无明显变化。5.Western blot结果显示,在A549细胞中敲低TRIM22并感染RSV24 h,48 h,LC3II的表达量均较对照组减低;在A549细胞中敲低TRIM22并感染RSV48 h,荧光显微镜观察LC3的表达,敲低TRIM22组LC3蛋白的表达量较对照组减低。6.经免疫共沉淀证实,TRIM22与自噬相关蛋白ULK1、Beclin1存在相互作用。小结:1.RSV感染诱导A549细胞LC3II增加,LC3蛋白在胞浆中散在分布。2.RSV感染诱导A549细胞自噬相关蛋白ULK1、Beclin1高表达。3.RSV感染诱导A549细胞完全的自噬流反应。4.敲低TRIM22抑制了RSV感染诱导的自噬。5.TRIM22通过结合自噬相关蛋白ULK1、Beclin1增强自噬,促进RSV复制。结论:1.RSV感染可以诱导A549细胞TRIM22、TRIM14、TRIM21、TRIM25和TRIM38蛋白表达升高。2.TRIM22促进了RSV在A549细胞中的复制。3.TRIM22通过作为自噬相关蛋白ULK1、Beclin1的装配平台促进RSV复制。