副溶血弧菌是一种重要的食源性病原菌,是一种革兰氏阴性菌,感染后主要定殖在宿主的肠道。食用生的或者未煮熟携带副溶血弧菌的海鲜产品可导致急性肠胃炎,常见的感染副溶血弧菌的临床表现有腹痛、腹泻、恶心、呕吐并伴有发热等症状。副溶血弧菌除了给人类健康带来巨大危害,还给海产品养殖业带来巨大经济损失。耐热直接溶血素(TDH)、耐热相关溶血素(TRH)、Ⅲ型分泌系统(T3SS)、Ⅵ型分泌系统(T6SS)和黏附素等是副溶血弧菌常见的毒力因子,此外运动性也和副溶血弧菌的毒力相关。其中Ⅲ型分泌系统(T3SS)与副溶血弧菌的肠毒性有关,其分泌的效应蛋白在副溶血弧菌的致病性发挥重要作用。幼兔模型常被用来研究副溶血弧菌肠道致病性,通过对其减毒机制进行研究,有望为副溶血弧菌感染的防控提供新视野、新思路。前期研究通过Tn-seq在幼兔模型体内试验成功筛选出副溶血弧菌230个减毒基因,其中包括VP0058(gntR)。本研究通过同源重组的方法构建ΔgntR缺失株、质粒回补株,用幼兔模型模拟肠道感染进行验证,通过一系列的体外实验对ΔgntR缺失株的生物学特性进行评价,进一步通过RNA-seq的方法筛选GntR蛋白的下游调控基因并进行鉴定。1.副溶血弧菌ΔgntR突变株的构建及其生物学特性鉴定利用同源重组的原理成功构建出ΔgntR基因缺失突变株,野生株和突变株同时感染三日龄的幼兔,缺失株感染的幼兔腹泻和肠道病变显著减弱,并且肠道定殖能力也显著减弱,进一步证明ΔgntR缺失株具有明显的减毒效果。基于此,进一步测定了副溶血弧菌野生株和ΔgntR缺失株的生长曲线、运动性和酸应激试验。生长曲线结果表明野生株和ΔgntR缺失株的生长无明显差异,运动性的检测结果也无显著差异,说明GntR并非通过运动性调控副溶血弧菌宿主肠道定殖。酸应激的结果表明无论是在pH 6.5还是pH 5.5的应激条件下,与野生株相比ΔgntR缺失株对酸的耐受能力表现出明显的下降,而回补株又恢复到与野生株相当的水平。因此,我们认为ΔgntR缺失株在酸性环境中存活能力显著减弱,推测这是AgntR缺失株在幼兔肠道中定殖量减少的原因之一。2.gntR基因调控副溶血弧菌葡萄糖酸盐利用系统介导其肠道定殖GntR蛋白是一个转录调控因子,通过转录组测序的方法筛选GntR蛋白的下游调控基因。结果表明副溶血弧菌中357个基因的表达受GntR调控,其中61个基因表达上调,296个基因表达下调。KEGG信号通路分析显示葡萄糖酸盐利用系统基因的表达受GntR蛋白的调控,blast 比对发现该基因簇与霍乱弧菌的葡萄糖酸盐利用基因(edd、gntK、gntT和eda)具有较高的同源性。qRT-PCR进一步验证了在ΔgntR缺失株中edd、gntK、gntT和eda的转录水平显著上调,而回补株又恢复到与野生株相当的水平。生物信息分析发现edd-gntK-gntT-eda基因簇含一个双向的启动子区域,EMSA结果发现GntR蛋白可以直接结合到该启动子区域抑制葡萄糖酸盐系统基因的表达,而葡萄糖酸盐可以竞争性的抑制这一结合作用,诱导葡萄糖酸盐利用系统基因的表达。此外我们发现ΔgntR和Δgnt(ΔeddΔgntKΔgntTΔeda)在以葡萄糖酸盐为唯一碳源的M9培养基中不能存活,有意思的是当同时添加了葡萄糖和葡萄糖酸盐时ΔgntR缺失株依然不能生长。进一步研究发现在低浓度(10uM)的葡萄糖酸盐条件下,ΔgntR缺失株依然不能生长,而当浓度上升到50 uM后,又可以继续生长。在低浓度(10 uM)葡萄糖酸盐情况下gntR基因缺失导致下游葡萄糖酸盐利用基因的过表达,葡萄糖酸盐代谢的中间代谢产物过量积累抑制细菌的生长,导致其肠道定殖量减少;而在高浓度(50 uM)葡萄糖酸盐条件下,出现反馈抑制,葡萄糖酸盐利用基因表达水平减弱,突变株又恢复生长。在副溶血弧菌的防治过程中,由于抗生素滥用导致细菌耐药性加重,本研究中关于GntR的调控机理和葡萄糖酸酸盐在其中扮演的角色,为副溶血弧菌的防控提供了新思路和方向。