论文部分内容阅读
目的： 克隆RPL30、SBP2和EFsec三个反式作用因子基因，并构建其哺乳动物细胞表达载体，然后与重组质粒pcDNA3.1-iGFP-Sepp1共转染HEK293细胞，研究三个反式作用因子对硒蛋白P基因表达的影响。为实现硒蛋白P在哺乳动物细胞中高效表达奠定基础。 方法： 应用RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中扩增RPL30基因，利用双酶切法将其连入真核表达载体pcDNA3.1（+）；采用半合成-酶连法EFsec基因中所缺失的片段补齐，用PCR方法扩增拼接产物，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）；真核表达载体pCMV-XL4-SBP2购自OriGene生物公司；将三个反式作用因子表达质粒与硒蛋白P表达质粒按照不同的组合方式，采用脂质体转染法瞬时转染HEK293细胞；采用RT-PCR法检测三个反式作用因子的表达及其对硒蛋白P基因转录水平的影响。 结果： 成功克隆RPL30基因并构建其表达载体pcDNA3.1-RPL30；准确地将EFsec-基因补齐了其5′端缺失的基因序列，并成功地构建了表达载体pcDNA3.1-EFsec；RT-PCR方法联合条带平均密度值分析证实，转染组与正常组相比，目的基因RPL30、SBP2和EFsec的mRNA水平显著增高，表明转染成功并有效表达。 结论： 反式作用因子RPL30、SBP2和EFsec基因哺乳动物细胞表达载体的成功构建以及其超表达后对硒蛋白P基因转录水平的作用分析，为深入研究硒蛋白P的生物合成机制打下了基础。