研究背景：强直性脊柱炎(Arlkylosing Spondylitis，AS)是一种以男性为主的与HLA-B27相关的炎症性脊柱与关节病变，其伴发的骨质疏松症是该病本身病理变化的一个方面。AS相关性骨质疏松症是一种威胁患者生长发育和生命健康的严重炎症性关节疾患，其不仅是骨骼系统严重并发症之一，还是脊柱畸形，压缩性骨折以及容易合并脊髓损伤的重要危险因素。近来，越来越多的研究表明，AS相关的骨质疏松是由于骨形成减少所致。研究发现，在类风湿关节炎等炎症性疾病中，存在炎症活动性增强与骨代谢失衡，导致骨质疏松的发生。破坏的主要原因是由于炎症细胞单核细胞一巨噬细胞浸润和激活所释放的细胞因子有关，其中肿瘤坏死因子(TNF-α)做为一种巨噬细胞分泌的细胞因子具有促进骨吸收，和抑制骨形成的作用。大量研究表明，AS患者血清TNF水平明显升高，可能加速骨质破坏，导致骨质疏松，低水平的TNF-α可能在预防和治疗AS相关的骨质疏松方面起着重要的作用。但目前对于TNF-α作用的分子机制尚不清楚。 CHIP是一种新发现的泛素连接酶E3酶，分子量大小为35kDa，可降解未折叠蛋白，在蛋白质的平衡调控中起着重要的作用。我们前期的研究发现，在AS患者的单个核细胞中存在未折叠蛋白的过多积聚，可能是AS发病机制之一。故我们推测在AS患者中CHIP可能存在高表达，促进未折叠蛋白的降解。新近研究发现，CHIP对诱导骨形成的重要的细胞因子BMP-2信号通路具有负调节作用，进而影响骨代谢，抑制骨形成。有研究报道，TNF可促进泛素连接酶E3酶的表达，而激活泛素蛋白酶体通路。我们推测TNF可能上调泛素酶E3酶CHIP的表达，CHIP的过表达对BMP-2信号通路调节，影响骨代谢过程。 众多研究表明，单核-巨噬细胞在伤口愈合和骨修复中起着重要的作用，BMP是唯一能够单独诱导骨形成的细胞因子，其中BMP-2是主要的调节骨形成的信号蛋白，在骨修复中起重要作用。故认为，BMP-2可能在单核-巨噬细胞中高表达，具有促进骨形成作用。 本研究对AS患者及THP-1细胞系中CHIP及BMP-2的表达进行检测，探讨二者在AS相关骨质疏松发病机制中作用的研究，旨在为AS的治疗提供新的思路。 方法： 1.运用酶联免疫吸附法，定量检测38例AS患者(25例活动期)及28例正常人血清中TNF的含量。 2.取38例AS患者及28例正常人的外周血，分离单个核细胞，采用Westernblot，荧光定量PCR等方法对AS患者及正常人的单个核细胞及TNF刺激前后的THP-1细胞系中CHIP基因及蛋白的定量表达情况进行检测。 3.体外试验，将THP-1细胞中加入10ng/mL的LPS和不加LPS，分为两组，培养24 h后，分别收集为无刺激条件培养基和刺激条件培养基，细胞用于荧光定量PCR检测BMP-2基因的表达；在人骨髓基质干细胞中加入无刺激条件培养基、刺激条件培养基及含抗bmp-2抗体的无刺激条件培养基，分为三组。三天后，加入细胞裂解液以测其碱性磷酸酶活性。 结果：1.TNF-α在各组血清中的表达与ESR的关系：活动期AS组与正常对照组之间差异有显著性(P值均<0.05)，稳定期AS组与正常组对照之间差异无显著性(P>0.05)。38例AS患者血清TNF水平与红细胞沉降率呈显著正相关(r值分别为0.669；P值<0.01)。 2.AS患者单个核细胞及THP-1细胞系中CHIP蛋白及基因的表达：在25例活动期AS患者中，CHIP蛋白表达明显高于正常组(P<0.05)；13例稳定期的AS患者CHIP的表达较正常组高(P>0.05)，但无统计学差异。TNF-α刺激的THP-1细胞组CHIP的表达明显高于无TNF刺激的THP-1细胞组(P<0.05).同时，我们用荧光定量PCR对CHIP基因的表达进行检测，得到与上述相同的结果。 3.AS患者单核细胞及THP-1细胞中BMP-2的表达：荧光定量PCR方法检测了LPS刺激前后的THP-1和AS患者及正常人单个核细胞中BMP-2的基因表达，LPS刺激后THP-1较刺激前THP-1中BMP-2表达明显下降，二者比较有显著差异(P<0.05)。活动期AS患者单个核细胞中BMP-2的表达低于正常人组(P<0.05)。 4.碱性磷酸酶活性的测定：我们在体外用刺激的条件培养基、无刺激的条件培养基和含抗bmp-2抗体的无刺激条件培养基，对hMSC进行培养，测其碱性磷酸酶的活性，发现，无刺激条件培养基组碱性磷酸酶的活性明显高于刺激条件培养基组(P<0.05)；含有抗bmp-2抗体的无刺激条件培养基组碱性磷酸酶活性明显下调，低于无刺激条件培养基组碱性磷酸酶的活性(P<0.05)。 结论：1.AS患者血清TNF-α水平明显高于正常人，并且与红细胞沉降率有良好的相关性，提示TNF-α水平可能提示疾病的活动期或严重性。 2.CHIP在活动期AS患者高表达，提示CHIP在AS的发病机制中可能有重要的作用。 3.体外试验中，TNF-α上调单核巨噬细胞系THP-1中CHIP的表达，提示TNF-α与CHIP之间存在着密切的联系，为我们进一步探讨TNF-α是否对CHIP调控BMP调节骨形成通路有影响提供了依据。 4.BMP-2在单核一巨噬细胞系中有表达，AS患者单核细胞中BMP-2较正常人表达下调，提示炎症细胞可能在AS患者的骨代谢中起着重要的作用。 5.体外试验证明，THP-1中表达的BMP-2对人骨髓基质干细胞有促成骨分化的作用，提示在炎症性关节病中，炎症细胞还可能通过对BMP-2的表达来调节骨代谢，诱发骨质疏松。