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极端嗜热古菌主要生存于深海热液口、火山口、陆地热泉等高温环境,其最适生长温度在80℃以上。高温会增加DNA中碱基脱氨基的速率,造成碱基损伤,而对这些损伤碱基在被修复之前进一步复制会引起基因突变的发生。胞嘧啶脱氨基形成尿嘧啶,是DNA中最为常见的脱碱基类型。通常在其被修复之前,复制DNA中尿嘧啶会造成G:C到A:T的突变。尿嘧啶DNA糖苷酶（Uracil DNA glycosylase,UDG）是细胞启动碱基切除修复途径进行修复DNA中尿嘧啶的第一个关键酶。UDG广泛分布在细菌、古菌、真核生物以及一些病毒中。根据其识别底物的专一性,UDG分为六个家族。目前,基因组已测序的极端嗜热古菌至少编码一种UDG。极端嗜热嗜压古菌Thermococcus barophilus Ch5于大西洋中脊（Logachev油田烟囱,3020米深）的深海热液区分离得到,其最适生长温度为85℃,最适生长压力为40 Mpa。T.barophilus Ch5的基因组编码两个UDG（Tba UDG194和Tba UDG247）,其对应的基因分别为TbCh5v12287和TbCh5v10629。本论文以Tba UDG247为研究对象,研究了该酶切除DNA中尿嘧啶的生化性质,分析了该酶切除DNA中尿嘧啶的催化机理。第一部分研究内容主要是利用分子生物学技术对Tba UDG247进行了基因克隆、诱导表达与蛋白纯化。通过使用聚合酶链式反应技术对Tba UDG247基因进行扩增,将酶切后的Tba UDG247基因连接至pET-30a（+）中。随后将测序验证成功的重组质粒热激活转化至感受态细胞诱导表达目的蛋白。通过细胞破碎、热处理和Ni柱亲和纯化等步骤得到Tba UDG247蛋白。第二部分主要研究了Tba UDG247切除DNA中尿嘧啶的生化性质。从实验结果来看,重组的Tba UDG247在65℃下仅切除ssDNA和dsDNA中的尿嘧啶,但不能切割正常的ssDNA和dsDNA,并在70～75℃下表现出最适的切除活性。Tba UDG247在4.0至11.0的pH范围内能切除DNA中的尿嘧啶,最适pH为7.0～9.0。此外,Tba UDG247的活性与二价金属离子无关;但是,Zn2+和Cu2+都完全抑制该酶的活性。高NaCl浓度也抑制该酶的活性。另外,Tba UDG247切除DNA中尿嘧啶效率的顺序为U-ssDNA≈U:G-dsDNA>U:T-dsDNA≈U:C-dsDNA>U:A-dsDNA。动力学结果显示,Tba UDG247以相似的速率切除ssDNA和dsDNA中的尿嘧啶。结合实验结果表明,Tba UDG247结合含有尿嘧啶的ssDNA的能力要强于其结合含有尿嘧啶的dsDNA的能力。本论文的第三部分内容研究了Tba UDG247切除DNA中尿嘧啶的催化机理。极端嗜热古菌Sulfolobus tokodaii UDG的晶体结构显示,氨基酸残基E42、N82、H164和F55包裹着尿嘧啶,推测它们可能具有识别尿嘧啶的功能。Tba UDG247中的E118、N159、H126和Y127分别对应S.tokodaii UDG中的E42、N82、H164和F55,暗示着这些氨基酸残基是该酶切除DNA中尿嘧啶的关键位点。为了证实这一假说,本论文利用定点突变技术,构建了Tba UDG247突变体E118A、N159A、H126A和Y127A。按照野生型Tba UDG247蛋白的诱导表达和纯化方法,对上述四个突变体蛋白进行了表达与纯化,并分析其切除和结合DNA中尿嘧啶的能力。研究发现,E118A、N159A和H216A突变体完全失去了切除活性并保留了较弱的结合活性,表明氨基酸残基E118、N159和H216对于Tba UDG247切除和识别DNA中的尿嘧啶是必需的。但是,Y127A突变体显示出与野生型蛋白相似的切除和结合DNA中的尿嘧啶的活性,暗示着氨基酸残基Y127可能在维持该酶的蛋白质构象方面发挥作用。本论文的第四部分内容探讨了 Tba UDG247具有双功能酶活性的特征。通过对Tba UDG247与其他源自极端嗜热古菌和细菌的UDG的氨基酸序列比对,我们发现该酶缺失存在于其他极端嗜热古菌和细菌UDG中的一些保守结构域。系统发育树分析结果表明,Tba UDG247仅存在Thermoccous属中,而属于第四家族的Tba UDG194存在Thermoccous属和Pyroccous属中,暗示着Tba UDG247为Thermoccous属特有的UDG。进一步的系统发育树分析结果表明,Tba UDG247介于家族Ⅳ和家族Ⅴ之间,位于一个独立的分支,暗示着该酶为新家族的UDG,可能具有新的功能。切割DNA实验结果的发现,Tba UDG247不仅能够切割DNA中尿嘧啶与脱氧核糖的N-C糖苷键,去除尿嘧啶从而产生AP位点（Apurinic/Apyrimidinic）,而且能够进一步切割该AP位点。因此,Tba UDG247具有糖苷酶和AP裂合酶的两种活性。由此可见,Tba UDG247不同于已报道的单功能UDG,即只具有DNA糖苷酶活性,而类似于双功能的8oxoG DNA糖苷酶,即具有DNA糖苷酶活性和AP裂合酶活性。本论文发现了Tba UDG247为一种新型的双功能UDG,揭示了该酶从DNA中切除尿嘧啶的生化性质,并阐明了该酶切除DNA中尿嘧啶的关键氨基酸残基。本论文关于Tba UDG247生化性质、催化机理、系统发育分析等方面的研究成果,为阐明极端嗜热古菌DNA中尿嘧啶的碱基切除修复途径提供了重要的线索。此外,本论文关于Tba UDG247新功能的发现,为揭示UDG的进化关系提供依据,也为单、双功能DNA糖苷酶的演化提供了重要的证据。另外,本论文所研究的Tba UDG247,具有热稳定性,暗示其在分子生物学技术研究领域具有潜在的应用前景,也丰富了深海嗜热环境极端酶资源。