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冠脉血管平滑肌细胞在冠脉血管的发育及冠心病的发生发展中起着重要作用。明确冠脉血管平滑肌细胞的起源及其分化机制有助于使其更好地应用于先天性冠脉血管病变的预防以及冠脉血管再生等领域。目前认为胚胎心外膜祖细胞是冠脉血管平滑肌细胞的主要来源之一。上皮-间质转化(EMT)是不同心外膜祖细胞群从心外膜迁移入胚胎心脏并最终分化为心系细胞的主要机制。多种信号通路可调控心外膜祖细胞经EMT转化向冠脉血管平滑肌细胞的分化过程。胚胎心外膜祖细胞是一个表达Tbx18、Wt1、Tcf21等多种标记基因的祖细胞池。转录因子Tbx18在哺乳动物胚胎心脏发育过程中起着重要的作用。基因谱系示踪技术证实Tbx18+心外膜祖细胞是一群具有向冠脉血管平滑肌细胞等间质细胞分化的祖细胞亚群。胚胎心血管系统的发育是在低氧微环境中进行的。低氧诱导因子HIF-1α是低氧信号的关键上游因子,参与调控冠脉血管形成发育。并且低氧能够通过HIF-1α调节肿瘤细胞等的EMT转化过程。低氧诱导发育相关基因的表达,并促进冠脉循环系统的发育。研究表明敲除HIF-1α会导致冠脉血管畸形、间质细胞死亡、心脏环化异常等改变。1因此,明确低氧对Tbx18+心外膜细胞向冠脉血管平滑肌细胞分化的作用及相关机制具有重要的临床意义。基因谱系示踪技术在胚胎发育研究领域广泛应用。本研究通过构建Tbx18:Cre/R26REYFP和Tbx18:Cre/R26RLacz两种Tbx18基因谱系示踪模型,并通过体外低氧干预由该模型示踪培养的Tbx18+心外膜祖细胞,以及在体构建E14.5天胚胎心外膜低氧模型,探讨低氧对Tbx18+心外膜祖细胞向冠脉血管平滑肌细胞诱导分化的作用及其主要调控机制。第一部分:通过谱系示踪模型培养体外示踪的Tbx18+心外膜祖细胞目的:探讨通过构建Tbx18基因谱系示踪模型培养Tbx18+心外膜祖细胞的方法,为体外研究Tbx18+心外膜祖细胞的分化机制奠定基础。方法:雄性Tbx18:Cre小鼠以及Cre报告小鼠分别与C57BL/6雌性小鼠交配,经基因型鉴定并筛选出杂合子后代繁殖。杂合子状态的Tbx18:Cre雌性小鼠分别与R26REYFP、R26RLacz雄性小鼠以3:2比例交配,提取胎鼠基因组并通过基因型鉴定筛选出Tbx18基因谱系示踪模型。通过E11.5天Tbx18:Cre/R26REYFP/Lacz双杂合示踪胎鼠心脏建立命运示踪的Tbx18+心外膜祖细胞体外培养模型。观察培养细胞的自身特性,并通过荧光显微镜及Lacz染色技术观察Tbx18+心外膜祖细胞特异的YFP荧光和Lacz染色;通过免疫荧光和q RT-PCR技术检测Tbx18基因的表达,明确获取细胞的纯度。结果:成功繁殖Tbx18:Cre小鼠及Cre报告小鼠,并建立Tbx18基因命运示踪模型。通过Tbx18:Cre/R26REYFP/Lacz示踪模型培养出体外示踪的Tbx18+心外膜祖细胞群。其中,通过Tbx18:Cre/R26REYFP示踪模型培养出的Tbx18+心外膜祖细胞在荧光显微镜下表达特异的绿色荧光,而通过Tbx18:Cre/R26RLacz示踪模型培养出的Tbx18+心外膜祖细胞Lacz染色呈深蓝色。结论:通过基因谱系示踪技术培养的Tbx18+心外膜祖细胞方法相对简单、细胞纯度高。Tbx18+心外膜祖细胞从心脏表面直接爬出后形成的细胞群形态和排列均与其在心脏表面近似,有利于Tbx18+心外膜祖细胞分化机制的后续研究。第二部分:体外低氧诱导Tbx18+心外膜祖细胞向冠脉血管平滑肌细胞的分化目的:探讨低氧信号诱导Tbx18+心外膜祖细胞向冠脉血管平滑肌细胞的分化及相关机制方法:通过氯化钴诱导Tbx18+心外膜祖细胞的低氧反应。分别通过荧光共聚焦和免疫组化观察低氧干预后Tbx18:Cre/R26REYFP/Lacz示踪的Tbx18+心外膜祖细胞的平滑肌细胞标志物α-SMA和Myh11的表达。分别观察细胞在低氧组、常氧组、低氧HIF-1α阻断组、对照组培养后,Tbx18+心外膜祖细胞向冠脉血管平滑肌细胞分化的比例的差异。通过免疫荧光和q RT-PCR方法观察低氧干预及阻断HIF-1α后Tbx18+心外膜祖细胞EMT转化相关指标的变化。通过Transwell实验观察各组细胞迁移能力的差异。结果:低氧干预诱导了Tbx18+心外膜祖细胞向冠脉血管平滑肌细胞的分化。随着低氧干预的时间延长,分化比例逐渐升高;而阻断HIF-1α后,低氧诱导的分化比例明显下降。低氧干预使Tbx18+心外膜祖细胞的ZO-1表达下降,Snail表达升高;阻断HIF-1α后,抑制了低氧对ZO-1及Snail表达的影响。低氧干预促进了Tbx18+心外膜祖细胞的迁移能力。结论:低氧干预能诱导Tbx18+心外膜祖细胞向冠脉血管平滑肌细胞的分化。低氧的诱导分化作用主要是通过HIF-1α调控该细胞的EMT过程来实现的。Snail是低氧状态下HIF-1α的下游作用因子。第三部分:构建在体心外膜低氧模型并诱导Tbx18+心外膜祖细胞的提前分化目的:在组织水平明确Tbx18+心外膜祖细胞向冠脉血管平滑肌细胞分化的潜能。探讨在体诱导心外膜低氧对Tbx18+心外膜祖细胞分化的影响及相关机制。方法:通过Tbx18:Cre/R26REYFP/Lacz命运示踪模型在体观察Tbx18+心外膜祖细胞向冠脉血管平滑肌细胞的分化。通过孕鼠持续吸入低氧(15%O2浓度)的方法构建E14.5天胎鼠心外膜低氧模型,并用低氧探针观察心外膜低氧状态随时间的改变。通过荧光共聚焦技术观察α-SMA、Myh11等血管平滑肌细胞标志物以及snail、sulg等EMT调节因子在E14.5天胚胎心外膜低氧模型Tbx18+心外膜祖细胞的表达。通过Lacz染色观察低氧干预后Tbx18+心外膜祖细胞及其衍化细胞的迁移改变。结果:免疫荧光显示血管平滑肌细胞标志物α-SMA和Myh11均在E16.5和新生小鼠冠脉血管壁与Tbx18:Cre/R26REYFP示踪小鼠的YFP荧光共聚焦。E18.5天Tbx18:Cre/R26RLac Z示踪小鼠的心脏Lacz染色结果显示,冠脉血管壁细胞Lacz染色呈阳性。低氧探针及HIF-1α的免疫荧光显示孕鼠吸入低氧后3小时E14.5天胎鼠心外膜开始出现低氧。并且随着孕鼠吸入低氧时间的延长,心外膜持续性处于低氧微环境。低氧模型小鼠的部分Tbx18+心外膜祖细胞表达α-SMA、Myh11和snail。与常氧组比较,低氧干预对Tbx18+心外膜祖细胞及其衍化细胞的分布无明显影响。结论:谱系示踪模型表明部分冠脉血管平滑肌细胞来源于Tbx18+心外膜祖细胞。心外膜的在体低氧诱导了Tbx18+心外膜祖细胞的提前分化。