研究背景和目的结肠癌是常见的消化道肿瘤之一,根据世界卫生组织国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)的资料显示,2012 年全世界约有136万结肠癌新发病例,是全世界男性恶性肿瘤中的第3位,女性恶性肿瘤的第2位,位于肺癌、乳腺癌之后;死亡约69万例,位于肺癌、肝癌和胃癌之后,居恶性肿瘤第4位[1]。大部分的结肠癌不只有一个风险因素,除了年龄和性别,还有很多的危险因素值得注意,如结肠癌家族史、炎症性肠病、吸烟、过量饮酒、肥胖以及糖尿病等。我国国内最常见的癌症中,结肠癌继胃癌、肺癌和食管癌之后排在第4位,且其发病率呈逐年上升的趋势[2]。结肠癌的治疗与其他大多数肿瘤相似,主要也是通过外科手术切除病灶,但除外部分早期患者疗效尚可,仍有约半数结肠癌患者术后会出现转移和复发的情况。晚期结肠癌和手术切除病灶后的患者仍需进行相应化疗,而目前的化疗药物仍存在不良反应大、不能长期应用以及单一用药效果差等缺点。因此,对结肠癌发病病因、机制的深入研究以及新的干预靶点的寻找都有着极为重要的意义。目前结肠癌发生的具体分子机制尚未完全明确。通常认为结肠癌的发生是一个多步骤、多阶段和多基因参与的复杂过程,在此过程中常伴有癌基因激活、抑癌基因失活、细胞周期紊乱、凋亡、错配修复基因改变以及端粒酶活性的增加等[3]。肿瘤的生物学特征是细胞失控性增殖,其主要分子机制包括肿瘤细胞周期紊乱导致细胞增殖过多和肿瘤细胞调亡减少。目前的研究认为细胞周期调节机制的破坏是肿瘤发生的重要原因之一。细胞周期监控机制失活伴随细胞周期驱动机制强化是导致细胞失控性增殖的重要原因[4]。细胞周期的调控涉及包括周期蛋白、周期蛋白依赖性激酶及其抑制剂在内的多因素相互作用。细胞周期中,G1期到S期转变对周期调节起着重要的作用,其中与G1期有关的周期蛋白主要有cyclin D1和cyclin E,与G1期相关的细胞周期抑制蛋白分有P21和P27。研究报道,约30%的结肠腺癌患者临床标本中存在cyclin D1蛋白的表达上调,这种表达上调的现象可能是结肠癌发生的早期事件;cyclin E在结直肠正常黏膜、增生性息肉、腺瘤到结肠癌中的表达水平呈逐渐升高的趋势,说明了 cyclin E可能与结肠癌的早期发生和发展有关。相反,结肠癌组织中P21、P27的表达水平显著低于癌旁正常组织,并与原发肿瘤浸润深度、区域淋巴结转移以及TNM分期显著负相关[5]。细胞调亡又称细胞程序性死亡,是由多种基因参与严格控制的细胞自主性死亡的过程,在细胞生长分化过程中的具有重要的意义。细胞凋亡过程是维持机体内环境稳定的重要环节,一方面可以清除机体坏死细胞,另一方面可以将已经完成使命的衰老细胞清除。细胞调亡的发生目前认为可能与癌基因及抑癌基因的异常表达有关。PBLD又称MAWBP,定位在10q21.1区域,是全长50.268bp的一个基因,其转录本有a和b两种亚型。PBLD最早于2001年由Iriyama C等以MAWD(丝氨酸/苏氨酸受体激酶相关蛋白)为诱饵通过酵母双杂交的方法,从人肝脏cDNA文库中筛选得到了全长的目标克隆[6]。Pubmed Gene数据库中显示广泛分布于人的大脑、心脏、肺脏、肝脏、胰腺、肾脏和胃肠道等各种组织中。文献报道中对其编码蛋白的氨基酸序列分析,发现从低等到高等物种,该基因均普遍表达,相对保守,因而推测该基因可能与生物某些基本生理功能有关。目前的文献报道包括以下方面:PBLD的表达水平在胰岛素抵抗、叶酸缺乏症和高血压等一些疾病中升高[7];PBLD在胃癌及肠癌组织中表达下调,认为PBLD可能成为胃癌新的蛋白标志物之一[8];MAWBP与其配体MAWD通过对TGF-beta通路的抑制达到抑制胃癌细胞EMT的目的[9];PBLD在肠癌组织中低表达,并通过体内体外实验发现PBLD抑制肠癌细胞的增殖、侵袭以及肿瘤形成能力,诱导肠癌细胞周期阻滞于S或G2/M期[10];通过分析溃疡性结肠炎和正常组织的差异蛋白表达谱,发现PBLD在溃疡性结肠炎组织中表达下调,并通过免疫组化进一步证实[11];PBLD可通过MAPK信号通路抑制HepG2细胞的增殖、侵袭和转移[12]。课题组前期初步分析了 PBLD在结肠癌增殖、侵袭、迁移中的作用,发现过表达PBLD可能通过抑制EMT过程达到抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭能力的目的。综上所述,我们对PBLD的功能做出初步猜想,认为PBLD在肿瘤发生发展、细胞周期、炎症过程中发挥作用,认为PBLD属于潜在的抑癌基因。在课题组前期研究的基础上利用实时定量PCR和组织芯片的免疫组化的方法分析结肠癌患者中PBLD基因的表达以及该基因表达丰度与患者临床特征、预后的关系;同时通过慢病毒转染在结肠癌细胞系LoVo中上调目的基因PBLD,分析上调PBLD对结肠癌细胞增殖能力、细胞周期以及凋亡的影响,检测细胞周期和凋亡相关因子mRNA及蛋白水平的表达差异,探讨其可能的分子机制。方法:1、结肠癌组织中PBLD表达与患者临床特征及预后情况的分析(1)肠癌标本的收集:所有标本均取自南方医科大学南方医院普外科手术切除的结肠癌及癌旁组织(经医学伦理委员会批准,且征求并获取患者及其家属同意)。(2)结肠癌组织中PBLD的检测:利用实时定量PCR方法检测56例肠癌组织及相应癌旁组织中PBLD的表达水平,同时分析不同分化程度的结肠癌组织中PBLD的表达差异。(3)PBLD表达水平与肠癌患者临床特征及预后间关系的分析:利用组织芯片(上海芯超)对76例结肠癌患者的肠道手术标本进行PBLD免疫组化染色,分别利用X2检验分析PBLD与肠癌患者的临床指征之间的相关性,利用Kaplan-Meier法分析PBLD与肠癌患者生存时间的关系。2、PBLD对结肠癌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响(1)慢病毒载体转染并筛选稳定过表达PBLD的结肠癌细胞株LoVo,并通过Western Blot和实时荧光定量PCR验证。(2)CCK8法检测过表达PBLD对结肠癌细胞增殖能力的影响;克隆形成法检测过表达PBLD对结肠癌细胞集落形成能力的影响;流式细胞术检测过表达PBLD对结肠癌细胞周期及凋亡的影响。(3)实时荧光定量PCR和Western blot检测过表达PBLD后结肠癌细胞周期及凋亡相关因子基因和蛋白水平表达的改变。结果:1、PBLD在结直肠癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织;(1)实时荧光定量PCR检测发现56例结直肠癌患者中有39例患者(69.64%)结直肠癌组织中PBLD mRNA的平均表达水平显著低于癌旁组织(p<0.01)。同时,结直肠癌组织的分化程度越低,PBLD mRNA相对表达水平越低。(2)免疫组织化学染色发现PBLD在结直肠癌组织中的阳性表达率为73.68%(56/76),低于癌旁正常组织的阳性率100%(76/76),差异有统计学意义(X 2=23.03,P<0.001);结肠癌组PBLD的强阳性表达率为9.21%(7/76),低于癌旁正常组织的强阳性率48.68%(37/76),差异有统计学意义(X2=28.79,P<0.001)。2、PBLD的表达水平与肠癌患者的预后显著相关;(1)结合实时荧光定量PCR检测结果和患者的临床特征发现,PBLD的表达水平与肠癌组织的分化程度(P=0.006)密切相关,PBLD表达水平越高,肠癌组织的分化程度越高;(2)结合免疫组化结果和患者的临床特征及预后情况分析发现,PBLD的表达水平与肠癌组织的分化程度(P=0.004)和肿瘤的AJCC分期(P=0.008)密切相关,生存分析显示PBLD阳性表达组结肠癌患者的总体生存时间显著高于阴性表达组患者。3、过表达PBLD抑制结肠癌细胞增殖,阻滞细胞周期并促进结肠癌细胞早期凋亡的增多(1)过表达PBLD抑制结肠癌细胞增殖:CCK8法显示PBLD过表达抑制结肠癌细胞增殖(P<0.01);克隆形成实验显示PBLD过表达组结肠癌细胞集落形成能力显著下降(P<0.001);(2)过表达PBLD影响结肠癌细胞周期的分布:流式细胞术显示PBLD过表达组结肠癌细胞存在明显的细胞周期分布异常,以G0/G1期阻滞为主,差异有统计学意义(P<0.05);(3)过表达PBLD促进结肠癌细胞早期凋亡的发生:Hoechest33258染色示:PBLD过表达组结肠癌细胞中凋亡细胞增多;Annexin V-APC/7AAD流式检测发现PBLD过表达组细胞早期凋亡比例增多(P<0.05);4、Western blot及qPCR检测显示,PBLD过表达组结肠癌存在cyclin D1、cyclinE2、CDK4、Bc12 表达下调以及 p21、Bax、cleaved-caspase3 表达上调的现象。结论:1、PBLD在结肠癌组织中的表达显著低于癌旁正常组织。2、PBLD的表达水平与结直肠癌分化程度及结直肠癌患者的AJCC分期密切相关,结直肠癌分化程度越高,PBLD表达越高,临床分期越早。PBLD阴性表达组患者的术后生存时间明显低于阳性表达组,预后更差。3、PBLD表达上调抑制结肠癌细胞增殖能力。4、PBLD表达上调抑制肿瘤细胞周期进程并促进肿瘤细胞早期凋亡的发生,这可能与过表达PBLD下调cyclin D1、cyclinE2、CDK4、Bc12以及上调p21、Bax、cleaved-caspase3 有关。