荨麻疹(uricaria)是一种极为常见的过敏性皮肤疾病,又称为“风疹块”或“风团。它的发病率高达20%。荨麻疹属于免疫系统变态反应性疾病,主要表现为因皮肤、黏膜小血管扩张及渗透性增加而出现的一种局限性水肿反应。临床上,根据病程长度与发病频率将其分为急性荨麻疹(acute urticaria, AU)与慢性荨麻疹(chronic uricaria, CU)。AU通常表现为短期内痊愈,病程持续6周以下。相反,CU是指风团反复发作,并连续超过6周以上的荨麻疹。其发病机制极其复杂,受遗传、环境以及免疫等多因素共同影响,病因难以确定。研究表明,AU主要由!型变态反应引起,即过敏原引发IgE以Fc段与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的Fc肥大细胞受体结合,引发肥大细胞脱颗粒反应,释放组胺、花生四烯酸衍生物等过敏介质,引起平滑肌收缩、免疫细胞迁移、毛细血管扩张、以及腺体分泌增加等病变。同时,有研究表明,CU的患者的皮损组织中,常伴有趋化因子诱导的嗜酸粒细胞、中性粒细胞、CD4+T淋巴细胞等免疫细胞的浸润以及Thl/Th2的失衡。因此,趋化因子,作为最大的细胞因子亚家族之一,对诱导免疫细胞的迁移有重要作用。根据趋化因子的蛋白质的一级结构,氨基末端单个或两个半胱氨酸是否直接比邻或插入其他氨基酸,将其分为CC趋化因子,CXC趋化因子,C趋化因子,CX3C趋化因子。其中,CC趋化因子不仅具备趋化作用,还能参与免疫调节、抗病毒免疫、调节细胞代谢,同时在慢性荨麻疹发病过程中可促进组胺的释放而参与过敏反应。研究表明,可分泌CC型趋化因子的嗜酸粒细胞在CU的皮肤损害处大量地出现。CC型趋化因子通过将嗜酸粒细胞趋化到反应部位,导致嗜酸粒细胞分泌包括大量嗜酸粒细胞衍生的神经毒、嗜酸粒细胞阳离子蛋白以及嗜酸粒细胞过氧化物酶的毒性成分,从而引起荨麻疹皮肤的组织损伤和瘙痒等临床症状。作为一种常见过敏性皮肤疾病,荨麻疹患者体内免疫T辅助细胞Th (T he1per)细胞的平衡起非常重要的调控作用,且受到趋化因子的调控。Th细胞可分化为Thl细胞和Th2细胞。正常情况下两者在机体内维持着动态平衡。当机体Th1/Th2的动态平衡被打破,出现Th1/Th2漂移,Th0向Thl分化过多,往往引起自身免疫性疾病和迟发性超敏反应发生；另一方面,当Th0向Th2分化过多,往往引起哮喘、CU等过敏性疾病发生,当机体免疫功能异常或低下时,Th2细胞及其细胞因子调控CU的患者血清中IgE水平升高。目前,IgE介导的Ⅰ型变态反应与Th1/Th2细胞平衡被认为是CU发生的主要调控机制。趋化因子与Th1/Th2细胞失衡与分泌的细胞因子和变态反应中的介质有相互作用。因此,阐明趋化因子在荨麻疹发生中的作用对于CU的治疗具有重要意义。目前对于CU的治疗关键是鉴别、清除病因和减少接触诱发因素。CU发病重要基础是IgE介导的Ⅰ型变态反应,继而引起肥大细胞与嗜碱性粒细胞脱颗粒现象。近年来,过敏原检测及特应性免疫治疗是国际变态反应界广泛开展的一项新型的检测及治疗方法。皮下注射特异性免疫治疗(SCIT)作为临床的经典免疫方法曾经得到了广泛的应用,但由于安全性不足而被舌下特异性免疫治疗(sublingual immunotherapy, SLIT)所替代。SLIT作为唯一针对过敏性疾病的对症治疗,由于疗效显著、安全性高、使用方便,在临床上获得广泛应用。它是一种通过使变应原明确的患者反复多次接触相应的剂量逐步递增至维持剂量变应原,帮助患者从根本上脱敏的治疗方法。相比一次静脉注射大剂量过敏原,舌下给药变应原能够更加方便、安全地对患者进行过敏刺激。变应原与上皮细胞结合穿过口腔黏膜,其后被树突状细胞捕获到达淋巴结,与原始的CD4+T细胞相互作用,调节Th1/Th2平衡与相应细胞因子的分泌。其可能的作用机理是利用封闭抗体(主要是IgG型),使变应原与相应抗体结合,从而阻断IgE结合变应原,形成不产生变态反应的免疫复合物。它具有副作用小、疗效持久的显著优势,目前在治疗CU的疗效中得到广泛临床认可。但是有效SLIT对CU的治疗效果和内在机制的尚未完全阐明。本课题旨在研究CC型趋化因子CCL11(嗜酸粒细胞活化趋化因子,eotaxin-1), CCL17 (thymus and activation-regulated chemokine), CCL26 (eotaxin-3)以及CCL27 (cutaneous T cell-attracting chemokine)在CU发病机制中的作用,从而为制定相应的治疗方案提供依据。同时初步探究了特异性免疫治疗在治疗CU患者中的临床疗效与对四种趋化因子表达的影响,旨在为CU的特异性免疫治疗提供临床和实验室的依据。本研究的第一部分首先应用定量实时荧光聚合酶链式反应(qRT-PCR)与基于Luminex平台的液相芯片多因子检测Bioplex技术检测了27例AU (AU)患者,24例CU (CU)患者,以及25例健康志愿者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中四种趋化因子CCL11、CCL17、 CCL26、CCL27mRNA表达水平与血清中的蛋白含量,并包括25例健康人作为对照。另外,还应用ELISA法检测]PBMCs中 CCL11、CCL17、CCL26、CCL27与血清中Thl和Th2细胞因子以及IgE含量的相互关系。并利用统计学的方法分析四种趋化因子与患者病程、UAS评分以及Th1/Th2分泌的细胞因子之间的相关性。本课题的第一部分研究发现,CUPBMCs中的三种趋化因子CCL11、 CCL17、CCL26的mRNA表达水平和蛋白含量显著高于健康者(P<0.05)。并且,在AU的患者PBMCs中表现更为显著(P< 0.05)。CCL27的mRNA表达和蛋白含量虽在AU组患者中显著增加(P<0.05),但在CU患者中略有下降(P>0.05)。荨麻疹患者PBMCs中趋化因子含量的改变,指示其与荨麻疹发生具有相关性。Thl细胞因子IL-2、TNF-α的表达在AU组和CU组患者中均显著降低(P<0.05),且CU组显著低于AU组(P<0.05)；Th2细胞因子IL-4表达在AU组和CU组患者中均显著增加(P<0.05),且CU组显著高于AU组(P<0.05),Th2细胞因子IL-10表达在CU组患者中显著增加(P<0.05),并高于AU组患者(P<0.05),指示荨麻疹的发生伴随Thl/Th2失衡。 进一步分析患者血清中Thl与Th2分泌的细胞因子发现,AU患者的CCL17和CCL27与Thl细胞因子呈负相关性；其CCL11、CCL17和CCL27与Th2细胞因子呈正相关性。CU患者的CCL17、 CCL26和CCL27与Thl细胞因子呈负相关性；其CCL17和CCCL27与Th2细胞因子呈正相关性；其CCL11仅与Th2细胞因子的IL-4具有正相关性(P<0.05)；其CCL26与Th2细胞因子呈负相关性,进一步证明Thl、Th2与荨麻疹的发生发展有显著相关性。然而,调控CU的重要免疫球蛋白IgE的水平,在AU组和CU组患者中较对照组均无显著变化(P>0.05)。而且CU患者PBMCs中趋化因子含量与血清总IgE和外周血嗜酸性粒细胞计数无显著相关性(P>0.05)。以上结果表明,CU能够促进Th0细胞向Th2细胞分化,同时抑制Th0细胞向Thl细胞分化,破坏机体Th1/Th2的动态平衡。而CCL11、CCL17、CCL26、CCL27不仅与Thl/Th2平衡相关,而且与荨麻疹的严重程度密切相关,因而可作为AU、CU潜在的辅助诊断指标,对未来荨麻疹病情及时诊断具有重要临床意义。在第二部分研究中,采用变应原点刺试验方法对CU患者进行了过敏原的检测,并和正常对照比较,特别是比较这两者在主要的过敏粉尘螨阳性率方面的差异。将对粉尘螨过敏的CU随机分成两组,一组采用SLIT治疗方法,另一组接受常规的抗组胺治疗作为对照组。研究两组在疗效上的差异以及对PBMCs中四种CC型趋化因子,Th1/Th2细胞因子表达水平的差异。研究发现,CCL17、 CCL26和CCL27在荨麻疹中、重度患者组中的表达水平显著高于轻度组和中度组(P<0.05)。表明趋化因子CCL17、CCL26和CCL27水平与荨麻疹的严重程度成正相关,这对荨麻疹病情诊断具有一定意义。而经过两种治疗后,SLIT免疫治疗组患者的症状积分下降指数SSRI在治疗后第16周和24周分别为(0.41±0.19)和(0.73±0.21),对照组患者第16周和24周的SSRI分别为(0.31±0.15)和(0.47±0.18)。统计分析表明SLIT免疫治疗显著高于对照组(P<0.05)。免疫治疗组和对照组总有效率分别为72.2%和33.3%,并且免疫治疗组显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。综上所述,SLIT治疗方法对荨麻疹治疗有效,且与常规抗组胺治疗方法有协同作用,同时也说明SLIT治疗CU的机制不同于抗组胺治疗。试验表明SLIT可显著降低CCL11, CCL17, CCL26表达水平(P<0.05),提高CCL27表达水平(P<0.05),增强Thl细胞因子IL-2、TNF-2表达水平(P<0.05),并降低Th2细胞因子IL-4与IL-10表达水平(P<0.05)。 结果提示SLIT可通过调节趋化因子CCL11, CCL17, CCL26, CCL27表达含量,显著纠正机体Th1/Th2漂移,恢复机体Th1/Th2的动态平衡,而常规治疗疗效不及SLIT,对趋化因子及Th细胞因子水平并无明显的改善作用,进一步证明趋化因子CCL11, CCL17, CCL26, CCL27与CU的发生发展有密切的关系,它们可能作为荨麻疹诊断及疗效评判的潜在生物标志物以及治疗CU的新靶点。综上所述,本研究通过检测多种趋化因子及Th1/Th2相关的细胞因子水平进行大量统计学分析,分析了在CU发生与治疗过程中趋化因子与Th1/Th2平衡及各种细胞因子含量之间的相关性。结果表明趋化因子CCL11、CCL17、 CCL26、CCL27调控Th1/Th2平衡。CU的发生机制中,趋化因子可能促使Th0细胞向Th2细胞分化,同时抑制Th0细胞向Thl细胞分化,从而升高Th2细胞因子,降低Thl细胞因子,破坏机体Th1/Th2的动态平衡,进一步显著地放大荨麻疹的症状。同时,CCL17、CCL26和CCL27水平与荨麻疹的严重程度密切相关。SLIT治疗CU疗效显著,这种显著效果可能与患者CCL11、CCL17、 CCL26、CCL27水平以及机体通过趋化因子等细胞网络来调节Th1/Th2平衡有密切的相关性。这些结果都进一步表明四种趋化因子CCL11、CCL17、CCL26、 CCL27深度参与荨麻疹的发病过程,可能作为潜在的荨麻疹病情活动评估的生物标志物,如果作为靶点,来阻断疾病发生发展,还具有的临床应用前景。另外,无论是从临床还是实验室的角度,对于确定变应原的CU, SLIT展示了有效的治疗效果,它能针对病因治疗,改善临床症状,减少疾病复发,对于发作频繁、症状顽固的患者也是值得推荐的疗法。本研究的技术亮点是利用液相多因子平台,检测血清中趋化因子含量。该方法相对于传统ELISA准确高效,节省珍贵的临床样本,而且能够在同一试验中获得多重因子检测结果,使获得的数据更为准确且具有可比性。本研究的不足之处在于获得的样本量较少,尤其是采用常规治疗作为对照组例数少,进一步的临床应用尚需更多样本进行系统评价与分析。而且这一复杂的CU调控机制有众多的趋化因子。未来以更多重的检测方法,揭示CU趋化因子表达谱的变化,对揭示CU调控机理将会有重大意义。