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目的:特发性肺纤维化（idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF）是一种病因不明的慢性间质性肺疾病，其发病机制尚未明确，以早期的肺泡炎症和晚期的纤维增生为主要特征。他汀类药物是一类3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzymeA，HMG-CoA）还原酶抑制剂，通过对HMG-CoA还原酶的抑制作用，使血清胆固醇合成减少。他汀类药物除降脂作用外，还具有抗炎、抗氧化、抗血小板凝集、改善内皮功能等作用，既往研究已表明他汀类的抗炎作用可改善肺脏、肝脏、肾脏等的纤维化，但其作用机制尚不明确。Krüppel样因子4(Krüppel-likefactor4，KLF4)是在多种组织中广泛表达的、具有双重功能的转录因子，在细胞的生长、增殖、分化和凋亡等众多生理活动中起着重要作用。近年来研究发现，KLF4与心血管疾病、肿瘤和炎性疾病等均有密切关系，而KLF4在炎症反应中的作用主要表现为对单核巨噬细胞表型偏移的调节。为了探讨KLF4在阿托伐他汀抑制实验性肺纤维化中的作用，本研究拟通过支气管滴注法建立小鼠肺纤维化模型，以观察KLF4基因和蛋白在肺纤维化小鼠肺组织中的表达，通过阿托伐他汀干预肺纤维化小鼠，观察阿托伐他汀干预后肺纤维化小鼠肺组织中KLF4的表达变化，并通过RNA干扰技术敲除巨噬细胞RAW264.7KLF4基因，观察KLF4对巨噬细胞细胞增殖、凋亡及细胞表型的影响，进一步探讨KLF4在阿托伐他汀改善实验性肺纤维化过程中的作用机制。
第一部分，KLF4在实验性肺纤维化小鼠肺组织中的动态表达
方法:
1.C57BL/6小鼠随机分为生理盐水对照组（Control）和博莱霉素组(BLM)，经气管内注入博莱霉素(2.5mg/kg)建立实验性小鼠肺纤维化模型，经气管内注入等量生理盐水作为对照组，分别于术后第12h、1d、2d、3d、7d、14d、28d取材;
2.采用HE染色和Masson染色观察肺组织病理变化及胶原的沉积部位和数量;
3.实时定量PCR法检测各组肺组织中KLF4mRNA表达水平;
4.免疫组织化学法检测各组肺组织中KLF4蛋白表达水平。
结果:
1.博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化过程中，第1、2、3天表现为急性炎症，第7天炎症加重，并出现胶原沉积，第14天肺泡结构塌陷，胶原沉积明显，第28天肺泡结构基本正常，炎症程度和胶原沉积较轻;
2.与对照组相比，BLM组小鼠肺组织中KLF4mRNA的表达水平第1天开始升高，而后降低，第3天达最低后逐渐升高直至第28天。
3.与对照组相比，BLM组小鼠肺组织中KLF4蛋白的表达水平与mRNA表达趋势基本一致，第1天开始升高，而后降低，第3天达最低后逐渐升高至第14天后再次下降。
第二部分，阿托伐他汀对实验性肺纤维化小鼠肺组织中KLF4表达变化的影响
方法:
1.将C57BL/6小鼠随机分为对照组(Control)、博莱霉素组(BLM)和阿托伐他汀组(ATO)，BLM组和ATO组一次性经气管内注入博莱霉素(2.5mg/kg)建立实验性小鼠肺纤维化模型，对照组注入等量生理盐水。ATO组在气管滴注BLM后给予阿托伐他汀灌胃10mg/(kg·d)，分别于术后第3d、14d、28d取材;
2.采用HE染色、Masson染色的方法观察肺组织病理变化及胶原的沉积部位和数量;
3.实时定量PCR法检测各组肺组织中KLF4mRNA表达水平;
4.免疫组织化学法检测各组肺组织中KLF4蛋白表达水平;
5.明胶酶谱分析法检测各组肺组织基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)的活性。
结果:
1.病理结果显示ATO组较BLM组炎症程度和胶原沉积明显减轻。
2.与BLM组(0.336±0.195)相比，ATO组(2.050±1.564)KLF4mRNA表达水平第3天明显上调，差异有统计学意义(P＜0.05)，第14天ATO组(0.464±0.110)较BLM组(2.000±0.435)明显下调，差异有统计学意义(P＜0.05)。
3.与BLM组相比，各时间点ATO组KLF4蛋白表达水平均下调，差异有统计学意义(P＜0.05)。
4.BLM组MMP-2活性较对照组明显上调，阿托伐他汀干预后MMP-2的活性明显下调，差异有统计学意义(P＜0.05)。
第三部分，KLF4对巨噬细胞细胞增殖、凋亡及表型偏移的影响
方法:
1.通过LipofectamineTM2000将短发夹RNA(shorthairpin，shRNA)干扰质粒转染至RAW264.7，经G418筛选获得稳定细胞株，获得的稳定干扰KLF4的RAW264.7细胞株命名为shKLF4，表达对照质粒的细胞株命名为NC，野生型RAW264.7细胞命名为WT;
2.实时定量PCR法(RT-PCR)和Western-blot法鉴定干扰效率;
3.RT-PCR法检测巨噬细胞表型偏移:
获得稳定干扰KLF4细胞株后，脂多糖LPS诱导巨噬细胞表型偏移，用RT-PCR法检测巨噬细胞表型标志物的相对表达量;
4.CCK-8法测定稳定细胞株的增殖活性;
5.流式细胞术检测巨噬细胞的细胞周期及细胞凋亡;
结果:
1.成功建立稳定干扰KLF4的细胞株，RT-PCR法和Western-blot法鉴定干扰效率达70％以上，;
2.RT-PCR法结果显示，LPS诱导后，抑制巨噬细胞KLF4的表达使M1型巨噬细胞标志物TNF-α，MCP-1及CCL5的表达降低(P＜0.05);
3.CCK-8法结果显示，降低巨噬细胞KLF4的表达使细胞增殖活性下降(P＜0.05);
4.流式细胞术结果显示，抑制巨噬细胞KLF4的表达促进巨噬细胞的凋亡（P＜0.05）;
结论:
1.KLF4在实验性肺纤维化发生发展中呈现明显的动态变化;
2.阿托伐他汀干预博莱霉素致肺纤维化小鼠后KLF4表达明显下调;
3.KLF4低表达对巨噬细胞的细胞周期无明显影响，但促进其凋亡，抑制其增殖，同时抑制巨噬细胞向M1型偏移;
4.阿托伐他汀可能通过抑制KLF4的表达来实现其在实验性肺纤维化中的抗炎和抗纤维化作用。