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库拉索芦荟(Aloe barbadensis miller),百合科多年生常绿多肉质草本植物,含有70多种对人体有益的物质。现己证实芦荟具有杀菌、消炎、促进伤口愈合、滋润美容、增强免疫、抗肿瘤、抗衰老等显著功效,作为添加剂或原料被广泛地应用于医药、美容化妆品及保健品中。库拉索芦荟主要病害为芦荟炭疽病、褐斑病和软腐病,一般发病率为10%-15%,重者可达20%—30%。由于芦荟是保健品,一般少使用化学农药防治病虫害,用转基因技术增强其抗性成为库拉锁芦荟病虫害防治的首选方法。
表皮生长因子(Human epidermal growth factor,hEGF)由于其医学、美容方面的巨大作用而在临床上得到广泛应用。近年来,商品化hEGF的市场价很高,高达210-1020美元每毫克。现阶段临床应用的hEGF多为原核生物基因工程产品,其蛋白结构和功能与天然产物可能存在一定差异。
抗菌肽Cecropin B是家蚕免疫防卫系统产生的一类对外源病原菌具有抑杀作用的活性多肽,其杀菌谱包括100多种致病菌、非致病菌及一些农作物常见的病原菌,特别是对一些耐药性菌株表现出良好的效果,而对正常组织和细胞无明显的毒副作用,具有传统抗生素无法比拟的优越性。
本实验构建能高效表达hEGF、Cep B蛋白的植物表达载体,希望转化后增强芦荟的抗病性,提高芦荟的药用价值,主要取得如下结果:
(1)人表皮生长因子hEGF基因的设计、合成根据人表皮生长因子的氨基酸序列及植物偏爱的密码子,合成寡核苷酸,基于PCR技术建立了简便的多肽基因(hEGF基因)合成方法。
(2)泛素Ubiquitin基因的克隆从库拉索芦荟中克隆了Ubi基因(收录号:EF539181),测序结果表明库拉索芦荟的Ubi基因核酸序列与同源基因相比存在一定差异,序列间同源性约在80%-100%之间,编码蛋白的氨基酸序列与目前报道的保守的泛素氨基酸序列完全一致,其氨基酸序列的高度保守符合已有报道。
(3)Ubi基因与目的基因的PCR连接由于目的蛋白只有连接于泛素C末端的76位Gly之后,Ubi才能从原初的融和蛋白上被正确切割下来,内切酶连接方法难以将Ubi基因与目的基因连接。本实验应用overlap extension PCR技术建立了高效的Ubi基因与hEGF基因及Cep B基因连接方法。
(4)高效植物表达载体的构建将目的基因分别与泛素基因连接,置于玉米泛素启动子下游,插入载体pCAMBIAl380构建了由玉米Ubi启动子驱动的3个高效植物表达载体:p-PE-1380、p-PUE—1380与p—PUC-1380。通过电激法将新构建的植物表达载体分别转入农杆菌EHA105中,并通过酶切与PCR鉴定,初步证实了质粒的转入。在本实验室以前的实验结果的基础上,参考陈廷速等的操作方法,本实验采用活力较强的美国库拉索芦荟茎段作为转化受体。进一步优化了芦荟转化的方法,获得了2棵抗性植株。