【摘 要】
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突触可塑性是学习记忆的重要机制,其主要包括长时程增强（long-term potentiation,LTP）和长时程抑制（long-term depression,LTD）。LTP在时间上分为早期LTP和晚期LTP。早期LTP主要涉及蛋白质的翻译后修饰,而晚期LTP则需要蛋白质的重新合成。已有大量研究表明磷酸化修饰参与了早期LTP的发生,而其他类型翻译后修饰在早期LTP形成中的作用还知之甚少。本课
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突触可塑性是学习记忆的重要机制,其主要包括长时程增强（long-term potentiation,LTP）和长时程抑制（long-term depression,LTD）。LTP在时间上分为早期LTP和晚期LTP。早期LTP主要涉及蛋白质的翻译后修饰,而晚期LTP则需要蛋白质的重新合成。已有大量研究表明磷酸化修饰参与了早期LTP的发生,而其他类型翻译后修饰在早期LTP形成中的作用还知之甚少。本课题研究蛋白质乙酰化动态修饰在早期LTP和学习记忆中的作用。蛋白质乙酰化分为N末端α-NH2乙酰化和赖氨酸ε-NH2乙酰化两类。N末端α氨基的乙酰化是一种不可逆的修饰方式,调节蛋白质的合成、稳定性和定位。而赖氨酸ε氨基的乙酰化是可逆的、动态调控的,因此可作为调控蛋白质功能的开关,在调节机体的生命活动中也更加重要,所以本课题涉及的是赖氨酸ε-NH2乙酰化,它受到赖氨酸乙酰转移酶（Lysine acetyltransferases,KATs）和赖氨酸去乙酰化酶（Lysine deacetylases,KDACs）的共同调节。现有研究表明神经活动通过调节组蛋白乙酰化促进基因转录而调节晚期LTP和长期学习记忆,但对于突触蛋白乙酰化是否参与早期LTP和学习记忆,目前还不清楚。前期质谱研究结果表明,钙调蛋白（Calmodulin,Ca M）乙酰化在小鼠脑内非常高频。Ca M是一种广泛表达于真核细胞的Ca2+传感器,主要位于胞浆和胞膜。Ca M可以结合蛋白激酶、G蛋白耦联受体和离子通道等效应蛋白,在Ca2+信号转导中处于枢纽地位。Ca M在调节突触可塑性中发挥重要作用,突触后膜上的NMDAR激活后,引起细胞内Ca2+内流增加,Ca M和Ca2+结合后被活化,进一步结合和激活钙调蛋白依赖性激酶IIα（Ca MKIIα）。Ca2+/Ca M/Ca MKIIα激活后介导的级联酶促反应对AMPAR的上膜和早期LTP的产生发挥重要作用。本课题采用乙酰化蛋白富集与检测的新方法,结合质谱学、生物信息学和结构生物学分析,运用了药理学、分子生物学和基因编辑（CRISPR/Cas9）等手段,研究钙调蛋白（Ca M）乙酰化动态修饰的调控机制,及其在突触可塑性和学习记忆中的功能。主要发现如下:1.小鼠前脑的乙酰化亲和质谱学分析发现了1245个乙酰化蛋白和2001个乙酰化赖氨酸位点,对其进行生物信息学分析表明,乙酰化蛋白在突触可塑性和学习记忆等神经生物学过程中高度富集。2.细胞转染筛选和体外乙酰化/去乙酰化实验表明,SRC3是乙酰化Ca M的一种主要的乙酰转移酶（KAT）,KDAC9和SIRT1是去乙酰化Ca M的两种主要的去乙酰化酶（KDAC）。3.结构生物学分析提示,Ca M乙酰化位点靠近Ca MKIIα而远离Calcineurin。体外GST pull-down和体外磷酸化/去磷酸化实验表明,Ca M乙酰化增强与Ca MKIIα的结合,并促进对Ca MKIIα的激活,而Ca M乙酰化对Calcineurin活性没有影响。4.化学LTP能够显著增加Ca M乙酰化,而化学LTD对Ca M乙酰化无明显作用。进一步研究表明,化学LTP通过NMDAR和SRC3增强Ca M乙酰化水平。抑制Ca M乙酰化可以削弱化学LTP引起的Ca MKIIα的激活。5.抑制SRC3活性或者敲除成年小鼠海马CA1区Src3基因可以显著抑制LTP的形成,在神经元内直接注入3KR-Ca M（Ca M不能乙酰化突变体）蛋白也可以显著抑制LTP的诱导。6.Ca M乙酰化水平在场景恐惧记忆的形成和巩固阶段显著升高,而在记忆提取后又恢复到正常水平。抑制SRC3只影响场景恐惧记忆的形成和巩固,而不影响记忆的提取。敲除成年小鼠海马CA1区Src3基因或表达3KR-Ca M蛋白可以显著抑制场景恐惧记忆。通过这一系列实验,得出以下结论:SRC3介导的Ca M乙酰化对早期LTP和场景恐惧记忆是重要的。本论文揭示了调节早期LTP和场景恐惧记忆新的分子机制,并对蛋白质乙酰化在神经活动中的调控机制和功能产生了新的认识。
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