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鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）主要感染1～8周龄雏鸭、火鸡和鹅等多种禽类,感染后以急性或慢性败血症和多发性传染性浆膜炎为特征。由于本病的高传染性和高死亡率,给养鸭业带来了巨大的经济损失。在临床分离株中,血清1型、血清2型和血清10型是国内最为流行的强毒菌株。虽然目前已报道了几种鸭疫里默氏杆菌的毒力因子,但是还没有从营养代谢方面揭示该病致病机制的研究。铁离子是绝大多数细菌生长所必需的营养元素,细菌从宿主中获取铁的能力是其毒力的重要决定因素。然而,宿主通过“营养免疫”机制极大地限制了铁的可利用度。而病原菌为了成功感染宿主在进化过程中产生了多种铁离子摄取机制,目前关于鸭疫里默氏杆菌的铁离子获取机制的研究还很匮乏。在本研究中,我们鉴定了鸭疫里默氏杆菌铁离子转运相关基因B7391343的功能,并评估了该基因缺失株作为一种候选弱毒疫苗的潜力。本研究的主要结果如下:1.鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1株B7391343基因缺失株及其回补菌株的构建生物信息学分析结果表明RA-CH-1 B7391343基因可能参与了铁离子的转运,而且该基因在不同的鸭疫里默氏杆菌血清型之间具有高度的序列相似性。为了进一步研究该基因的生物学功能,构建了该基因的缺失株和回补菌株。首先,扩增B7391343基因的左右两侧同源臂及壮观霉素抗性盒片段,通过融合PCR的方法将三片段连接起来,再连接到自杀性质粒pEX18GM,构建重组质粒pEX18GM::B7391343-USD;然后将该重组质粒转化入结合转移供体菌E.coli S17-1中,通过将该供体菌与受体菌RA-CH-1进行结合转移,通过卡那霉素和壮观霉素抗性筛选及多重PCR鉴定成功构建了基因缺失株RA-CH-1 △B739<sub>1343。另外,将RA-CH-1B7391343基因克隆到穿梭质粒pLMF03上,构建重组质粒pLMF03::B7391343,然后将该质粒导入基因缺失株RA-CH-1△B7391343中成功构建了回补菌株 RA-CH-1△B7391343 pLMF03::B7391343。2.鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1 B7391343基因的功能鉴定在TSB中的生长曲线测定结果表明,B7391343缺失后对鸭疫里默氏杆菌CH-1的生长没有明显的影响。然而在加入铁离子螯合剂Dip后,缺失株的生长受损程度比野生株更为明显,回补菌株的生长恢复到了野生株水平,表明在铁离子缺乏的环境中B7391343在RA-CH-1的铁离子摄取上发挥了重要作用。为了进一步验证该结论,同时检测了野生株,缺失株及其回补株在含有或者不含Dip的TSA培养基中的生长情况。我们发现这三株菌在TSA中的生长并没有差异;然而在限铁的TSA环境中,缺失株几乎不能生长,而回补菌株恢复了生长;表明B7391343在缺铁环境中参与了 Fe3+的摄取。另外,通过荧光定量PCR检测了 B7391343基因在富铁和限铁环境中的转录水平,结果表明该基因的转录不受铁离子的调控。3.鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1AB739.1343缺失株的毒力评估由于B7391343参与了鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1的铁离子摄取,因此我们推测B7391343也与RA-CH-1的毒力有关。首先通过测定细菌的LD50值,我们得知与野生型强毒株RA-CH-1相比,缺失株的毒力降低了约104倍。然后在雏鸭的混合感染模型中,我们发现缺失株RA-CH-1AB739<sub>1343在血液,肝脏和脑组织的竞争定殖能力明显低于野生株,表明B7391343有助于鸭疫里默氏杆菌在这些组织内定殖。综合以上结果表明B7391343是RA-CH-1的一个重要毒力因子。4.鸭疫里默氏杆菌RA-CH-1AB7391343缺失株作为弱毒疫苗的评估由于缺失株RA-CH-1AB739<sub>1343对雏鸭的致病力显著降低,我们进一步评估了该基因缺失株作为弱毒活疫苗的免疫保护效果。首先弱毒株的安全性评估结果表明该弱毒株对鸭的健康状况没有影响,可做下一步研究。免疫弱毒株后通过间接ELISA检测雏鸭体内的抗体水平,我们发现该弱毒株可以诱导机体产生特异性免疫应答。攻毒保护力试验结果表明该弱毒株RA-CH-1AB739<sub>1343对高剂量野生型强毒株RA-CH-1的保护率为83.33%。综合以上结果表明缺失株RA-CH-1 AB739<sub>1343可以作为弱毒活疫苗的一种潜在候选者。