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丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是引起人类丙型肝炎的病原体,其慢性化率高达85%,与肝硬化、肝细胞癌的发生密切相关,严重危害人类健康,已成为全球性的、重要的公共卫生问题。迄今,对HCV感染发病的机制认识不完全清楚,仍然缺乏有效的治疗方法,疫苗的研究也遇到很大障碍。在HCV感染过程中,病毒与细胞表面相应受体的结合是病毒感染复制的始动环节,因此探索HCV的受体在HCV感染发病中的作用一直是研究的热点问题。CD81、B族I型清道夫受体(scavenger receptor class B type I, SR-BI)与HCV包膜蛋白结合,参与HCV的入胞过程,目前已经证实,CD81和SR-BI同时存在是HCV感染肝细胞的必要条件,但一些非肝源细胞同时表达CD81和SR-BI,仍然不能被HCV感染,说明HCV感染肝细胞可能需要其它特异性因子的共同参与。最新研究发现,肝脏上高度表达的claudin-1在HCV入胞过程中发挥重要的作用,非肝源细胞在表达该分子后获得对HCV的易感性。Claudin-1是构成细胞间紧密连接的主要蛋白,有4个疏水的跨膜区,2个细胞外环结构(extracellular loop, EL),EL1与HCV入胞密切相关,针对claudin-1 EL1的抗体可以阻断HCV的感染;此外,claudin-1在介导细胞间HCV的传播中起关键作用,细胞间HCV传播可逃避宿主免疫系统中和抗体的作用,可能是HCV在宿主体内持续存在的重要原因。因此,深入研究claudin-1在HCV感染中的作用,有助于加深对HCV感染发病机制的理解,为抗病毒治疗提供新的思路。长期以来,缺乏可靠的供病毒繁殖与传播的细胞培养系统一直制约着HCV的研究,2005年Rockefeller大学HCV研究中心主任Charles M. Rice教授领导的实验室报道建立HCV感染细胞模型,解决了这一瓶颈问题。Rice教授惠赠的HCV体外培养系统(cell-culture derived HCV, HCVcc),为我们的研究奠定了良好的基础。为探讨claudin-1在HCV感染中的作用,本研究主要完成了以下三方面的工作:1 HCV体外培养系统使用Rice教授惠赠的包含HCV全长序列的2a型J6/JFH嵌合体质粒,酶切线性化后作为模版,在T7 RNA聚合酶的作用下,体外转录获得全长HCV转录本,产物经RNA电泳鉴定,并电穿孔转染至Huh-7.5细胞,包装出病毒颗粒,重新感染原始的(na?ve)Huh-7.5细胞,并检测病毒感染性。2 Claudin-1表达对HCVcc易感性的影响从HepG2细胞中克隆claudin-1基因,插入pEGFP-C3载体中,构建真核表达载体,脂质体法转染293T细胞,荧光显微镜与Western blot观察claudin-1的表达,检测claudin-1对HCVcc感染的影响;使用化学合成claudin-1 siRNA序列,抑制Huh-7.5细胞中claudin-1的表达,检测HCVcc感染性的变化。3γ干扰素对紧密连接的影响及其对HCV感染的影响γ干扰素是促炎细胞因子,可影响细胞紧密连接;γ干扰素还参与抗HCV免疫应答,本研究对γ干扰素在紧密连接及HCV易感性之间的作用初步探索。Transwell PET膜上培养的肠腺癌细胞系Caco-2细胞可形成极性结构,与体内的肝细胞相似,采用实时定量PCR与Western blot检测Caco-2细胞上的claudin-1、CD81及SR-BI的表达情况。比较Caco-2单层细胞在γ干扰素处理前后跨上皮电阻、FITC标记的葡聚糖渗透性以及Caco-2细胞间紧密连接超微结构的变化,通过激光共聚焦显微镜观察CD81、SR-BI及claudin-1在Caco-2细胞上的分布情况,检测γ干扰素对HCVcc感染性的影响。结果:1通过体外转录获得了FL-J6/JFH全长嵌合体HCV RNA转录本,经电穿孔转染Huh-7.5细胞,在培养上清中检测到HCV,用该培养上清可以感染原始的Huh-7.5细胞。2从HepG2细胞中克隆claudin-1基因,成功构建了claudin-1的真核表达载体pEGFP-claudin-1,脂质体法转染293T细胞,48 h后可检测到融合蛋白EGFP-claudin-1在293T细胞中的表达。293T细胞上外源性瞬时表达claudin-1后,获得对HCVcc的易感性。3化学合成的siRNA序列可以有效抑制Huh-7.5细胞上的claudin-1的表达,并阻断HCVcc对Huh-7.5细胞的感染。4 Caco-2细胞表达HCV的关键受体:CD81、SR-BI及claudin-1,支持HCVcc的感染。5γ干扰素可以下调claudin-1的表达,造成Caco-2细胞间紧密连接被破坏,通透性增加。γ干扰素同时影响claudin-1、CD81及SR-BI在细胞上的分布。γ干扰素处理后Caco-2细胞对HCVcc的易感性下降。结论:1紧密连结蛋白claudin-1是HCV的重要受体,影响细胞对HCV的易感性,可能与HCV的嗜肝性有关。2γ干扰素可以降低claudin-1的表达,破坏紧密连接,使CD81及SR-BI的分布发生变化,可能影响细胞对HCV的易感性。