喉移植被认为是喉功能重建的理想方法，目前临床上已经有两例喉移植成功的报道[1,2]，但是患者不得不长期应用免疫抑制剂，这必然增加了肿瘤复发、机会性感染和代谢性疾病的几率。应用去细胞技术制作低免疫原性的生物材料，已经在部分组织修复中得到应用[3-5]。早期的去细胞生物材料局限于皮肤、膀胱壁、小肠、心包等薄层组织或器官[6]。2008年Ott[7]等利用冠脉灌注法首次制作了小鼠心脏的去细胞生物支架，开启了整体器官去细胞生物支架的新时代。我科利用Ott[7]报道的方法成功灌注出了兔、犬喉支架，并完成了免疫学、力学等测试，证实了去细胞喉支架没有改变基质的生物力学性质，而且具有低免疫原性的特点[8-10]。但这种去细胞犬喉支架植入宿主体内能否长期存活尚不明确。本实验应用去细胞犬喉支架植入宿主犬胸大肌内，通过大体观察、组织学检查、软骨细胞存活率等指标明确该支架是否存活，进一步评估去细胞犬喉支架的性能，为全喉功能重建探索新方法。目的1.利用灌注法制备完整的去细胞犬喉支架，明确灌注前后犬喉形态、组织结构、免疫原性及软骨细胞活性的变化。2.通过动物体内埋植实验，明确去细胞犬喉支架能否在宿主犬胸大肌内长期存活，为下一步喉移植提供理实验基础和理论指导。方法1.制备去细胞犬喉支架及其相关检查实验组离体犬喉保留双侧环甲动脉，持续灌注十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecyl sulfate,SDS）、曲拉通X-100（TritonX-100）等去离子剂，去除喉黏膜、肌肉、韧带内强免疫原性的细胞成分，保留其无免疫原性的细胞外基质和低免疫原性的软骨细胞，得到低免疫原性的去细胞犬喉支架；行大体观察、组织学检查、免疫学检查及软骨细胞存活率检查。2.体内埋植实验分别将去细胞犬喉支架及喉标本植入实验组及对照组宿主犬右侧胸大肌内，于术后2周、1月、2月3个时间点处死宿主犬，取出埋植物，行大体观察，组织学检查及软骨细胞存活率检查。结果1.制备去细胞犬喉支架及其相关检查去细胞喉喉支架颜色变白，形态同正常喉，无塌陷、变形，灌注前后环状软骨左右径相比差异无统计学意义；HE染色可见喉支架内上皮细胞、肌肉细胞、腺体及血管均消失，软骨膜稍离散，软骨细胞填充于软骨陷窝内；灌注前后环甲肌脱氧核糖核酸(deoxyio nucleic acid，DNA)含量对比差异有统计学意义，而环状软骨、甲状软骨、会厌软骨DNA含量对比差异无统计学意义；去细胞犬喉支架环甲肌、环杓后肌、杓横肌等去细胞基质内无管家基因β-actin表达；灌注前后软骨细胞存活率差异无统计学意义。2.体内埋植实验所有宿主犬均存活至观察终点。大体观察：实验组埋植2周后喉支架颜色红润，表面有红色膜样物质附着；埋植1月后红色较前变深，表面软组织增厚，体积较前变小；埋植2月后喉支架表面软组织内肉眼可见血管形成；对照组埋植2周后颜色苍白、软骨变薄，关节断开，部分喉体周围有炎性分泌物，与周围肌肉无粘连；1月后可见小软骨片残存，软骨表面有结缔组织附着。环状软骨左右径比较：埋置后各时间点实验组与对照组对比差异均有统计学意义（P<0.05）；实验组组内环状软骨左右径比较：2周组与埋置前相比差异无统计学意义（P>0.05）；1月组与2周组比较差异有统计学意义（P<0.05），2月组与1月组相比差异无统计学意义（P>0.05）。对照组埋植2周后与埋植前比较差异有统计学意义（P<0.05）。苏木精-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色可见：实验组埋植2周后支架周围有白细胞浸润，而软骨细胞及软骨膜无明显变化；1月后支架表面有疏松结缔组织形成，高倍镜下可见成纤维细胞和血管存在；2月后疏松结缔组织增厚，成纤维细胞及血管数量增多，软骨膜稍薄，软骨细胞充填于软骨陷窝内。对照组埋植2周后标本周围大量淋巴细胞浸润，软骨膜尚完整，1月后标本周围大量结缔组织增生，软骨膜断裂，淋巴细胞进入软骨组织，软骨细胞大量吸收。软骨细胞存活率变化：实验组埋植2周组与埋置前、1月组与2周组、2月组与1月组比较差异均无统计学意义（P<0.05）。对照组2周组与埋置前、1月组与2周组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论1.通过环甲动脉灌注去离子剂可以得到完整的去细胞犬喉支架，该支架去除了肌肉和黏膜内强免疫原性的的细胞成分，保留了无免疫原性的细胞外基质和低免疫原性的软骨细胞；该支架的形态、大小、体积未发生明显改变，且生物力学性能未发生明显变化，可以作为生物工程材料进行下一步体内埋植实验。2.正常喉埋植2周后即诱发急性排斥反应，喉支架逐渐被破坏、消失。3.去细胞犬喉支架在体内埋植后未发生严重免疫排斥反应，2月后形态正常，体积稍变小，支架表面被疏松结缔组织覆盖，软骨细胞保持较高的存活率，可以为下一步全喉移植提供支持。