棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒(Helicoverpa armigera single nucleocapsidnucleopolyhedrovirus,HaSNPV)为杆状病毒核型多角体病毒属,是一类双链环状DNA病毒,其G4株全基因组的测序工作已经完成。该基因组共有135个开放阅读框(open reading frame),其中115个阅读框是保守的,20个是其特有的。ORF99是其中一个功能未知的基因。　　 ORF99由357个核苷酸组成,预计编码118个氨基酸,在起始密码子上游-62位和-49位分别存在早期启动子信号序列CAGT和TATA,在终止密码子下游68位存在ATAAA位点,从以上分析可知ORF99是一早期表达基因,对其表达的蛋白Ha99一级结构分析发现该蛋白等电点为8.80,为一碱性蛋白。　　 本文将ORF99克隆入pGEX-KG载体中,并将其与谷胱甘肽S转移酶(GST)融合在大肠杆菌BL21中进行原核表达,预期蛋白分子量大小为39.5kDa。经过多种条件的摸索,包括改变诱导剂IPTG的浓度,诱导时间,诱导温度,表达载体,表达宿主细胞等,我们最终得到融合蛋白GST-Ha99包涵体形式的大量表达,大小与预期分子量相符,表达结果还通过Western blot分析得到验证。该蛋白的成功表达为进一步研究其功能奠定了基础。　　 为了进一步研究ORF99的功能,我们在其上下游设计了一对同源臂,在棉铃虫单核衣壳核型多角体病毒改造杆粒HaBacHz8的基础上通过同源重组对ORF99进行敲除,得到ORF99缺失杆粒HaBac△99。另外,我们又在HaBac△99的基础上通过Bac-to-Bac系统将ORF99进行回复得到ORF99的回复杆粒HaBac-single Rep99。因为杆粒HaBacHz8与野生型棉铃虫核型多角体病毒相比不含有多角体基因,所以我们将多角体基因转移到HaBac△99中得到HaBac-K099,将多角体基因和ORF99同时转移到HaBac△99中得到HaBac—dual Rep99。由于杆状病毒有两种不同的病毒粒子:芽生型病毒粒子和包涵体型病毒粒子,所以带有多角体基因的HaBac—K099和HaBac-dual Rep99就能在包涵体型病毒粒子中进行ORF99功能的研究,而不带有多角体基因的naBac△99和HaBac-single Rep99就能在芽生型病毒粒子中进行ORF99功能的研究。因为HaBac△99中含有绿色荧光蛋白基因,这就为在细胞水平上研究ORF99的缺失对病毒复制的影响提供了方便。