目的由于缺乏预防性疫苗且治疗费用昂贵,慢性丙型病毒性肝炎仍然是世界范围内重大的公共卫生难题。目前丙型肝炎病毒(hepatitis C, HCV)感染慢性化机制尚不明确,有研究表明CD8+T细胞应答失败可能为HCV感染慢性化的重要机制之一。在欧美人群中的研究发现HCV病毒序列在宿主免疫压力下能够发生选择性逃逸突变,进而影响病毒特异性CTL应答。中国人群与欧美人群遗传背景不同,HCV在不同遗传背景人群中的逃逸突变可能不同。目前在中国乃至亚洲地区人群中尚无宿主遗传背景对于HCV逃逸CTL应答的研究。由于中国HCV主要基因型为lb型,且研究发现HCVNS3区存在较多CD8+T细胞表位,因此本研究拟扩增湖北地区人群HCV1b型NS3区序列,分析湖北地区HCV lb型序列变异情况,序列进化以及演变的规律：对湖北地区慢性HCV1b型患者进行HLA-A以及B类分子基因分型检测,分析湖北地区人群HLA-I类分子遗传背景与中国其他地区人群的异同之处,并比较数据库中中国人群以及德国人群HLA-A以及B类分子等位基因频率的异同；分析中国慢性HCV1b型NS3区在HLA-I类分子免疫压力下发生选择性逃逸突变的情况,比较不同遗传背景人群中HCV lb型NS3区选择性逃逸突变的差异；验证HCV在HLA-I类分子限制性表位内发生选择性逃逸突变对于CTL应答的影响。旨在明确中国人群宿主免疫压力下HCVlb型的选择性逃逸突变情况,探寻中国人群中HCVlb型选择性逃逸突变对HCV感染慢性化以及HCV特异性CTL应答的影响及其可能的机制。方法1.收集慢性HCVlb型感染患者全血,分离血清,抽提血清中HCV RNA,采用型别特异性引物扩增法进行HCV基因分型。对HCV1b基因型的HCV采用巢式PCR方法进行NS3区扩增并测序。使用生物信息学软件将HCV lb型患者的HCV NS3区序列进行序列比对,分析HCV NS3区的序列变异情况,并与其他地区HCV1b型NS3区以及德国anti-D人群NS3区序列进行序列比对以及进化树分析。2.分离血细胞,进行基因组DNA抽提,采用型别特异性引物PCR方法检测湖北地区HCV1b型患者相应的HLA-A及B类分子等位基因。分析本实验中人群HLA-A及HLA-B类分子基因频率,并比较德国人群与中国人群HLA-A及HLA-B类分子基因频率。3.使用生物信息学软件分析中国人群HCV1b型NS3区HLA-I类分子限制性CD8+T细胞表位内的序列突变是否与相应的HLA-I类分子相关。比较中国人群的突变情况与德国人群突变情况。4.使用合成多肽对表达相应的等位基因的慢性HCV患者的外周血淋巴细胞进行HCV特异性增殖以及再刺激后进行IFN-γ细胞内细胞因子染色,再使用流式细胞术检测分泌IFN-γ的细胞占CD8+T细胞的比值,进一步验证CD8+T细胞表位内的选择性突变对T细胞识别的影响。结果1.本实验共获得1b型HCV NS3区全长序列89例。所得序列经进一步进化树分析确认为1b型,且湖北地区序列与中国其他地区lb型序列亲缘性近,与日本、东南亚地区及欧美地区的lb型亲缘性远；将本实验扩增获得的中国HCV1b型NS3区与德国感染同一来源HCV污染的免疫球蛋白人群(anti-D cohort) NS3区以及德国散发感染人群的HCVlb型NS3区进行进化树分析,发现中国人群序列主要落于两个进化丛内,德国人群中anti-D cohort NS3区落于三个进化丛内,其他散发感染的lb型序列未见明显进化丛。在本实验中89例序列的两个进化之间,患者性别,年龄,病毒载量以及HLA-I类分子表达频率无明显差异,提示中国HCV1b型两个进化丛的产生主要是可能由于不同的两个原始感染源所致。2. HLA-A及B类分子分型检测结果显示：本实验中人群表达频率较高的HLA-A类分子有HLA-A*11(25.77%)、HLA-A*02(28.83%)、HLA-A*24(16.56%). HLA-A*30(4.91%)和HLA-A*33(9.82%),表达频率较高的HLA-B类分子有HLA-B*40(13.25％)、HLA-B*15(15.66％).HLA-B*13(13.86％).HLA-B*46(14.46%)以及HLA-B*58(9.64%)。湖北地区人群与数据库中中国人群的HLA-A及B类分子基因频率无明显差异。将数据库中德国人群HLA-A以及HLA-B类分子的表达频率与中国人群平均值进行比较,发现德国人群与中国人群的HLA-I类分子表达频率有明显差异：在HLA-A类分子中,中国人群中表达频率较高的HLA-A*11、HLA-A*24口HLA-A*33在德国人群中表达频率较低,而在德国人群中表达频率高的HLA-A*03以及HLA-A*01在中国人群中表达频率较低。在HLA-B类分子中,中国人群中表达频率较高的HLA-B*40、HLA-B*15、 HLA-B*13.HLA-B*51、HLA-B*58和HLA-B*46在德国人群中表达频率较低,而在德国人群中表达频率高的HLA-B*44、HLA-B*07、HLA-B*08以及HLA-B*35在中国人群中表达频率较低。3. HLA-A及HLA-B类分子限制性表位内选择性逃逸突变分析结果显示中国人群慢性HCV1b型感染患者体内存在HLA-A及B类分子免疫压力下的选择性逃逸突变。在九个CD8+T细胞表位内相应HLA-A及B类分子阳性患者的突变频率显著高于阴性患者,差异具有统计学意义。将本实验中HCV1b型序列在HLA-A以及B类分子的免疫压力下发生的逃逸突变与德国人群中的逃逸突变进行比较,发现两组人群HCVlb型在免疫压力下的选择性逃逸突变情况不同。4.体外T细胞功能检测实验结果验证了新的HLA-A*11表位NS31635-1644,证实了该表位内HLA-A*11压力下的V16351选择性逃逸突变能够影响CTL应答,NS31635-1644表位肽第二位的T1636N以及T1636S突变可影响CD8+T细胞应答,而1636位其他突变类型则不影响CD8+T细胞应答。NS31635-16441b型原型所占比例在HLA-B*75阳性患者中显著高于HLA-B*75阴性患者。结论本研究详细探讨了中国地区HCV lb型的NS3区序列变异情况,对中国地区HCVlb型序列的演变进行了分析,系统比较了中国不同地区以及中国人群与德国人群HLA-A、B类分子基因频率之间的差异,进行了中国人群HCV lb型在宿主免疫压力下逃逸突变的分析,以及体外T细胞功能检测实验。研究结果发现中国与德国人群的HLA-A、B类分子表达频率存在明显差异,同时进一步验证了中国HCV lb型可能存在两个主要感染源；发现中国人群中存在宿主免疫压力下HCV lb型的逃逸突变,且中国及德国人群HCV1b型在免疫压力下的选择性逃逸突变不同,提示在不同遗传背景人群中HCV lb型在宿主免疫压力下的选择性逃逸突变不同。我们还发现了HCV1b型新的HLA-A*11限制性表位,验证了HLA-I类分子免疫压力下HCV1b型病毒序列的逃逸突变能够影响CD8+T细胞应答,且表位肽不同位点的突变或相同位点不同的氨基酸突变对CD8+T细胞应答的影响各不相同,提示只有特定的氨基酸突变才能够影响CTL应答。NS31635-16441b型原型所占比例在HLA-B*75阳性患者中显著高于HLA-B*75阴性患者。提示该位点突变在HLA-B*75阳性患者中可能有恢复至原型的趋势,推测HLA-B*75对HCV1b中国一致序列感染的患者可能有保护作用。本研究于国内外首次分析了中国乃至亚洲地区人群遗传背景对于HCV lb型逃逸宿主免疫应答的影响,部分阐述了中国人群HLA-I类分子参与HCV lb型免疫逃逸的机制,为后续基于T细胞应答的HCV治疗性以及预防性疫苗的研发提供一定理论基础。