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龙眼(Dimocarpus longan Lour.)是原产于我国热带、亚热带特色水果。果肉自溶是龙眼果实采后常见的品质劣变现象之一,严重影响其食用价值和商品价值,也是影响龙眼长期贮藏和远距离运输的主要因素之一。研究表明,组蛋白去乙酰化酶和转录因子参与了植物生长、衰老过程。本论文通过克隆组蛋白去乙酰化酶和转录因子ERF基因,研究这些基因在果实发育和采后果肉自溶过程中的表达特性以及它们亚细胞定位及其互作,并探讨了它们在采后龙眼果肉自溶中的作用及其机制,为调控龙眼果肉自溶提供理论依据。主要研究结果如下:
1.采用RT-PCR与RACE相结合方法,首次从龙眼果实中克隆到1个组蛋白去乙酰化酶和2个转录因子ERF全长cDNAs,分别命名为DIHD2、DIERF1和DIERF2。序列分析表明,由DIHD2推导的氨基酸序列含有HDAC结构域、酸性结构域和锌指结构等特征序列;而由DIERFs推导的氨基酸序列含有大部分ERF所含有的保守AP2/EREBP结构域。此外,DIERF1属于Ⅲ次家族ERF,而DIERF2则属于Ⅳ次家族ERF;因此推测DIERF1和DIERF2可能行使不同的功能。酵母自激活和亚细胞定位实验表明DIERF1具有转录活性的转录因子。
2.Northern杂交结果表明,DlHD2和DIERFs与龙眼果肉发育有关。DIHD2在果肉的快速生长期出现表达峰,随后表达逐渐下降;DIERF1和DIERF2表达趋势基本一致,都随着龙眼果肉的成熟而增强。以上表明,DIHD2可能与龙眼果肉的快速生长有关,而DIERFs可能与龙眼果实的成熟相关。
3.DIHD2和DIERFs参与了龙眼采后果肉自溶。在常温25*C贮藏过稗中,龙眼果肉从第3d开始出现自溶。DIHD2、DIERF1和DIERF2分别在贮藏的2d、5d和4d表达最强烈;在低温40C贮藏过程中,龙眼从25 d开始出现果肉自溶。DIHD2和DIERF1分别在30d及35 d时表达最强,而DIERF2受低温抑制;在低温贮藏20 d转常温的果实果肉中,从6h开始出现自溶现象。DIHD2一直维持比较高的表达水平,DIERF1在36 h时出现表达量最大值,DIERF2则在48 h表达最高;低温40 d转常温贮藏后,DlHD2在6h表达量最高,DIERF1在36 h时出现表达最大值,DIERF2则在24 h表达最高。另外,NO处理能有效延缓龙眼果肉自溶,并促进DIHD2表达,但抑制DIERF表达。
4.酵母双杂交和双分子荧光互补实验证明,DlHD2和DIERF1蛋白之间存在相互作用,并且相互作用的部位存在于细胞核中。
5.采用Bisulfite sequencing法,通过对DIERF1启动子进行DNA甲基化分析,发现DIERF1在龙眼果实中的DNA甲基化位点主要是CpG,并且DNA甲基化水平很低,在衰老的果实DNA甲基化程度要比不衰老的果实高。