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真菌引起的临床感染率日渐上升,白念珠菌耐药是深部真菌治疗失败的主要原因,因此寻找有效的抗真菌药物和真菌耐药性的机制研究具有重要意义。白念珠菌ORF19.1985、ORF19.2328、ORF19.3296、ORF19.6219、ORF19.5322等基因表达峰值处于细胞周期G1或G1/S期;ORF19.4136、ORF19.4105、PRF19.658、ORF19.2174、ORF19.2440、ORF19.7494等基因在酿酒酵母中的同源基因参与DNA损伤修复,但上述基因在白念珠菌中的功能尚不明确,值得进一步研究。本课题首先利用基因敲除方法,分别构建含有目的基因上、下游同源重组片段的基因敲除盒,采用醋酸锂法转染白念珠菌SN152,通过两次同源重组,使亲本菌的基因被敲除盒同源重组,并通过基因组DNA套式PCR验证;构建了这些基因在白念珠菌SN152中的基因缺失菌c19.1985K2(△orf19.1985/△orf19.1985)、c19.2328K2(△orf19.2328/△orf19.2328)、c19.3296K2(△orf19.3296/△orf19.3296)、c19.6219K2(△orf19.6219/△orf19.6219)、c19.5322K2(△orf19.5322/△orf19.5322)、c19.4136K2(△orf19.4136/△orf19.4136)、c19.4105K2(△orf1 9.4105/△orf19.4105)、c19.658K2(△orf19.658/△orf19.658)、c19.2174K2(△orf19.2174/△orf19.2174)、c19.2440K2(△orf19.2440/△orf19.2440)和在以SN152为亲本菌的ORF19.7494基因缺失菌中的双基因缺失菌c19.7494K2/c19.4105K2(△orf19.19.7494/△orf19.19.7494△orf19.4105/△orf19.4105)、c19.7494K2/c19.658K2(△orf19.19.7494/△orf19.19.7494 △orf19.658/△orf19.658)、c19.7494K2/c19.2174K2(△orf19.19.7494/△orf19.19.7494△orf19.2174/△orf19.2174)、c19.7494K2/c19.2440K2(△orf19.19.7494/△orf19.19.7494△orf19.2440/△orf19.2440)。本课题对以上基因缺失菌进行了生物学功能上的研究,在不同培养基中考察了基因缺失菌的菌丝形成能力;利用微量液基稀释法和点板法分别考察了各基因缺失菌对唑类药物、盐刺激、渗透刺激、过氧化氢刺激、DNA抑制剂的敏感性是否改变;利用生长动力学实验考察了各基因缺失菌的生长曲线变化和倍增时间变化;通过荧光显微镜分别检测各基因缺失菌的细胞膜、细胞核形态。结果发现,ORF19.4136、ORF19.4105、ORF19.658、ORF19.2174、ORF19.2440、ORF19.7494等基因缺失菌以及双基因缺失菌对DNA抑制剂的敏感性与亲本菌比较更敏感;细胞变长,甚至有长菌丝状出现,且各基因缺失菌出现菌丝态细胞的比例不同;生长速率减慢;倍增时间延长;ORF19.4105、ORF19.658基因缺失菌的单个菌落形态发生改变;结果表明ORF19.4136、ORF19.4105、ORF19.658、ORF19.2174、ORF19.2440、ORF19.7494等基因在DNA损伤修复中起着重要作用,他们之间的具体作用机制及与白念珠菌的耐药性之间的关系有待进一步确定。此外,与亲本菌比较,ORF19.1985、ORF19.2328、ORF19.3296、ORF19.6219、ORF19.5322基因缺失菌的菌丝形成能力无差异;对各种药物的敏感性也无变化;生长曲线、倍增时间和细胞周期与亲本菌比较均无改变。利用体外药敏实验和棋盘式微量液基稀释法考察了 11种中药单体和10种中药提取物在白念珠菌SN152、上述各单基因缺失菌及双基因缺失菌中的MIC80。结果发现:上述目的基因不影响白念珠菌对11种中药单体和10种中药提取物的敏感性,同一中药单体或中药提取物在白念珠菌SN152(亲本菌)和以上基因缺失菌中的MIC80都一致;牡丹皮与氟康唑联合用药抗临床白念珠菌具有良好的协同作用(FICI<0.1);此外,对氟康唑敏感性一致的临床分离白念珠菌100和255对牡丹皮的敏感性差异很大,提示牡丹皮对其作用靶点可能不同。