自从1988年Saiki等将耐热性的Taq聚合酶引入PCR反应后,极大地推动了 PCR技术的推广,也带动了实时荧光定量PCR(qPCR)技术的兴起,分子生物学发展日新月异。随着技术的推广与应用,人们也逐渐发现了 Taq聚合酶自身存在的缺点,其保真性差不适合高保真的PCR,复杂样本扩增能力差需要对样本进行处理以及体系的优化等等。而B族的Pfu聚合酶具有高保真性、高行进性和强耐干扰能力,但是不具有5’-3’外切活性且强3’-5’外切活性会水解游离探针影响荧光增益信号检测而不能用于qPCR。因此本研究希望通过改造Pfu聚合酶,进而用于复杂样本的qPCR检测。基于Pfu聚合酶的结构和性质,我们采取了两种改进方案。首先,我们对Pfu聚合酶进行点突变改造获得了 Pfu-mut聚合酶,弱化了 3’-5’外切活性,使其不能水解游离探针而影响荧光定量结果,同时筛选不基于外切活性的非水解探针分子信标体系,进而用于qPCR。第二,在前者的基础上我们将Taq聚合酶N端的5’-3’外切活性域融合到Pfu聚合酶的N端,获得了具有5’-3’外切能力TNF-pfu-mut聚合酶,进而可以用于普通的Taqman水解探针。此外,我们还筛选了 Pfu聚合酶的抗体,抗体的加入对于Pfu聚合酶的热启动效果和稳定性具有较好的帮助。在对复杂样本的评价中,我们发现改造后的Pfu-mut聚合酶对于血清样本qPCR检测灵敏度略优于Takara公司HS-Taq约1个数量级(101倍),能够至少耐受约75%体积比的提取血清样本模板量而不影响qPCR灵敏度;对于高GC含量靶标的扩增灵敏度更是明显优于HS-Taq约3个数量级(103倍)。而TNF-Pfu-mut聚合酶的外切和聚合活性表现正常具有可行性,但是对于血清样本的qPCR检测灵敏度低于HS-Taq,对于高GC含量靶标的扩增效果较差,需要进一步改进。综上所述,本研究改造了 Pfu聚合酶并应用于qPCR检测,验证了其对于复杂样本qPCR的优势。为提高未来B族聚合酶的研究应用和qPCR聚合酶的选择提供更多的可能。