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衰老是生物界的普遍现象,是人体组织器官功能失衡的渐变过程,而在这一衰老事件干细胞起到了重要作用,干细胞在身体分布广泛,为机体的组织修复和自我更新提供细胞来源,因此当人体内干细胞出现老化会引发整个机体衰老。已有研究证明,细胞微环境与干细胞的衰老有密切联系,当微环境出现变化可直接影响干细胞的增殖、分化、凋亡、衰老。目前,间充质干细胞(Mesenchymal stemcells,MSCs)作为一种重要的成体干细胞受到了越来越多的关注。因取材方便、易于分离,低免疫原性,多向分化潜能优点,已广泛应用于细胞治疗和组织工程领域。同样也与机体的衰老密切相关。然而关于微环境与MSCs衰老之间的调控还不是很清楚,有些报道显示可能与抑癌基因异常表达有关。近年研究证实抑癌基因LKB1在细胞内通过调节AMPK参与体细胞代谢,其自身的去极化可被长寿基因SIRT1调控。近年nature报道LKB1在HSC稳态调节等方面起着重要作用,但其在衰老干细胞中的调节功能及作用机制还不是很清楚。因此,本文你拟研究微环境对MSCs衰老的影响,明确LKB1调控的衰老的分子机制,进而为干细胞老化和衰老相关疾病治疗起到积极的意义。本课题中我们分别通过组织块种植法、组织绞碎法、胶原酶消化法、梯度密度离心法从脐带、胎盘、骨髓、脂肪中分离出MSCs,流式检测显示四种MSCs均表达CD90,CD105,CD73;不表达CD11b,CD19,CD34,CD45,HLA-DR。在合适的诱导培养基作用下,四种MSCs均具有成脂、成骨和成软骨分化潜能。本研究中我们应用不同时段血清FBS、CS长期培养MSCs,进一步明确在不同血清微环境下MSCs增殖、分化、凋亡的改变,以及衰老相关基因表达已明确微环境调控MSCs衰老的分子机制。结果发现,FBS组MSCs的增殖和分化能力要优于CS组,而细胞的凋亡比率、p53等衰老相关基因的表达水平要低于CS组。我们的结果说明FBS能够对MSCs的生长提供一个更好的微环境,有助于保持其生物学特性,延缓衰老,而CS则会加速细胞的衰老进程,可能的机制是衰老相关基因的异常表达和MSCs分泌细胞因子(如IL-6,IL-8)的变化有关。除此以外,本实验应用PH值测定仪和冰点渗透压仪,调配PH值为6.5、7、7.5的间充质干细胞培养基,渗透压为300mOsm和350mOsm的间充质干细胞培养基,体外扩增MSCs,明确在不同酸碱、渗透压微环境作用下MSCs功能活性的变化,并通过real-time PCR检测衰老相关基因p53、p21、p16、AMPK、LKB1的表达变化情况。结果表明检测在PH值为6.5,渗透压为350mOsm时的微环境培养MSCs可诱导其出现老化及分化功能增强。为进一步研究间充质干细胞衰老,我们应用H2O2、高糖、阿霉素三种诱导剂制备MSCs衰老模型,同时检测它们对MSCs形态、增殖、分化等衰老表征的影响。成功筛选出并证明H2O2诱导衰老模型是高效而稳定。通过该模型我们比较了年轻、年老MSCs中的衰老基因p16,p21,p53以及lKB1的表达,发现伴随细胞衰老它们表达增强。当不同微环境作用下诱导MSCs衰老和分化的同时,LKB1表达是逐渐增强,衰老相关基因的表达也高表达,为明晰LKB1调控衰老MSCs的分子机制,我们重点检测了信号通路中的关键分子AMPK与GSK3表达变化。结果表明LKB1通过AMPK磷酸化促进MSCs衰老,此外,高表达LKB1也通过磷酸化GSK-3介导wnt信号通路,促进β-catenin蓄积影响MSCs老化进程。本研究表明,LKB1磷酸化下游靶蛋白AMPK与GSK3在MSCs衰老中发挥着关键的调控作用,可为MSCs衰老提供新的研究思路,并为延缓机体衰老提供新的理论依据。