【摘 要】
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随着荧光标记技术的快速发展,荧光显微成像技术由于具有高特异性,非侵入性的优势在生物成像方面应用非常广泛。荧光寿命作为荧光信号的其中一个参量,与荧光分子从激发态回到基态的退激发速率密切相关,能非常灵敏地反映荧光探针分子周围微环境变化或与其他分子相互作用的过程。相比传统的荧光强度成像,以荧光寿命为图像衬度的荧光寿命显微成像（fluorescence lifetime imaging microscop
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随着荧光标记技术的快速发展,荧光显微成像技术由于具有高特异性,非侵入性的优势在生物成像方面应用非常广泛。荧光寿命作为荧光信号的其中一个参量,与荧光分子从激发态回到基态的退激发速率密切相关,能非常灵敏地反映荧光探针分子周围微环境变化或与其他分子相互作用的过程。相比传统的荧光强度成像,以荧光寿命为图像衬度的荧光寿命显微成像（fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM）技术不受激发光强度、探针浓度、光漂白这些因素影响,可以实现对细胞微环境诸多生化参数的定量测量,例如氧含量、离子、代谢状态、猝灭剂分布、荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer,FRET）效率等,因此FLIM技术在生物医学、材料学、化学等领域应用越来越广泛。实现FLIM技术的关键在于荧光寿命信息的探测,其中应用最广泛的探测方法是时间相关单光子计数（time-correlated single photon counting,TCSPC）。这种方法具有灵敏度高、时间分辨率高、信噪比高等优点。但要获得准确的荧光衰减曲线用于拟合和计算荧光寿命值,要求单个激发周期内探测荧光光子数不超过1个,但同时又需要采集足够多的光子数,因而TCSPC-FLIM的成像速度通常比较慢。但在实际应用中,一方面科研人员在获取FLIM数据时希望采集时间越短越好;另一方面,许多生物学问题也要求成像速度足够快,例如在运动细胞器动态成像、活细胞囊泡运输过程追踪、蛋白质分子间相互作用等研究中。因此发展快速FLIM成像技术以满足上述应用需求具有非常重要的意义。本论文围绕如何提升TCSPC-FLIM成像速度这一问题展开研究,主要工作包括:1.在声光寻址扫描的TCSPC-FLIM技术基础上,通过对系统采集的同步方式和数据存储方式的优化,并发展相应的后期数据处理和荧光寿命图像重构方法,实现了对铃兰根茎组织切片样品任意数量、任意形状感兴趣区域（region of interest,ROI）的快速FLIM成像;2.结合声光寻址扫描、单粒子追踪（single particle tracking,SPT）和反馈控制,通过质心定位、反馈控制和采集同步等方面的优化,实现了对运动单粒子的追踪和快速FLIM成像;3.将贝叶斯分析（Bayes analysis,BA）算法应用于单粒子FLIM追踪采集的低光子数荧光寿命分析,进一步提升了系统的成像速度。本论文研究工作的创新点主要有:1.提出并实现了在三路同步模式下对样品内任意形状、任意数量ROI的寻址扫描TCSPC-FLIM成像方法,这在一定程度上提升了FLIM的成像速度;2.优化了之前的反馈控制程序,通过结合BA这种低光子数寿命分析算法,实现了基于反馈控制的单粒子快速FLIM追踪技术,有望为生物样品内运动目标的快速追踪提供一种新的研究方法。
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