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目的:利用实时荧光定量PCR(RT-FQ-PCR)方法检测VAD1 mRNA在新型隐球菌性脑膜炎(CNM)患者脑脊液中的表达,探讨VAD1 mRNA表达量与新型隐球菌(CN)数量、临床疗效和预后的关系,为将其应用于CN感染的诊断和疗效判断奠定基础。利用ELISA方法定量测定CNM患者的Th1/Th2细胞因子,结合其VAD1 mRNA表达量及临床表现,阐明三者之间的关系,拟从细胞因子水平探讨VAD1 mRNA的表达在CNM发生、发展中的作用以及为CNM的免疫治疗提供新的依据。方法:1.RT-FQ-PCR检测方法的建立:根据GenBank收录的新型隐球菌VAD1 mRNA全序列(AY-661864),设计特异性引物和TaqMan探针,以重组质粒pGEMT-Easy-VAD1为标准品,建立RT-FQ-PCR的定量标准曲线,并评价方法的灵敏度、特异度及重复性。2.RT-FQ-PCR法诊断效能的临床评价:利用RT-FQ-PCR法、墨汁染色法、真菌培养法及CN抗原测定法检测25例CNM组和30例对照组患者脑脊液,比较各法的诊断敏感度及特异度。3.RT-FQ-PCR法的初步临床应用:检测25例CNM患者抗真菌治疗前与治疗后脑脊液中VAD1 mRNA的表达量,分析VAD1 mRNA与CN数量、临床疗效和预后的关系。比较不同药物治疗组VAD1 mRNA的表达量的变化程度,从而评价它们CNM疗效上的差异。4.VAD1 mRNA与Th1/Th2细胞因子相关性研究:利用ELISA方法定量测定CNM患者的Th1/Th2细胞因子,结合其VAD1 mRNA表达量及临床表现,阐明三者之间的关系,确定VAD1在CNM致病和诊断中的作用,为揭示CN感染时,菌体致病与宿主防御之间所引发细胞因子分泌格局的变化,以及CN感染转归多样性的细胞免疫学和分子生物学基础。结果:1. RT-FQ-PCR检测方法的建立:成功建立了新型隐球菌VAD1 mRNA的RT-FQ-PCR检测方法。建立的标准曲线相关系数为-0.9979;检测线性范围为103～107拷贝数/μl;检测灵敏度为101拷贝数/μl;高、中、低浓度质粒标准品批内CV值分别为0.65%、0.89%和1.23%;RT-FQ-PCR法检测CN的敏感度为96%,特异度为100%。2.实时荧光定量PCR法诊断效能的临床评价:利用所建立的RT-FQ-PCR检测方法检测25例隐脑组和30例对照组患者的VAD1 mRNA,结果表明实时荧光定量PCR法的敏感度为96%、特异度为100%;墨汁染色法的敏感度为72%、特异度为100%;培养法的敏感度为64%、特异度为100%;抗原测定法的敏感度为96%、特异度为96.7%。明显高于墨汁染色法(χ2=4.167,P <0.05)及真菌培养法(χ2=6.125,P <0.05),与CN抗原测定法差异无统计学意义(χ2=0,P>0.05)。3.实时荧光定量PCR法初步临床应用:3.1 25例CNM患者急性期VAD1 mRNA表达量为3.042±0.906,巩固期为2.187±0.665,定量值经对数转换后进行t检验,结果t = 4.583,P<0.01,提示急性期与巩固期VAD1 mRNA表达存在显著性差异,急性期明显高于巩固期。3.2 VAD1 mRNA与隐球菌数量、颅内压及脑脊液葡萄糖浓度具有显著相关性(P值分别为<0.01,<0.01,<0.05)。其中VAD1 mRNA与隐球菌数量、颅内压呈正相关,与脑脊液葡萄糖浓度呈负相关。3.3两性霉素B(AmB)联用5-氟胞嘧啶(5-FC)组、5-氟胞嘧啶(5-FC)联用大扶康(FCZ)组、两性霉素B(AmB)与5-氟胞嘧啶(5-FC)及大扶康(FCZ)三联合用组三组药物治疗前后VAD1 mRNA表达量差异均有统计学意义(P<0.05),其中AmB+5-FC+FCZ组P<0.01;三组间两两比较时发现,三组药物治疗前后VAD1 mRNA表达量下降程度无明显差异(P>0.05)。4. VAD1 mRNA与细胞因子分泌格局的关系CNM组患者巩固期脑脊液IFN-γ、IL-12、IL-10水平与急性期相比均有显著差异,其中巩固期IFN-γ水平显著高于急性期,IL-12和IL-10水平显著低于急性期;CNM组患者急性期脑脊液IFN-γ/ IL-10、IL-12/ IL-10水平均低于正常对照组,巩固期IFN-γ/ IL-10、IL-12/ IL-10水平显著高于急性期。VAD1 mRNA表达量与IFN-γ呈显著负相关;与IL-10呈显著正相关;与IL-12不相关。结论:1.在国内外首次建立了新型隐球菌VAD1 mRNA的实时荧光定量PCR检测方法,有较高的敏感度、特异性及较好的重复性。为进一步探索新型隐球菌VAD1基因的功能及其与隐球菌病的发生、发展的相关性提供了方法学基础。2. VAD1 mRNA表达水平与疾病严重程度相关,其可能在新型隐球菌性脑膜炎的发生、发展中起作用,并有可能成为新型隐球菌感染的基因诊断、治疗的新靶点。3. VAD1 mRNA表达水平与新型隐球菌性脑膜炎的治疗效果有关,可能为新型隐球菌的毒力和致病性判断以及隐球菌性脑膜炎诊断、疗效判断和预后判断提供新的依据。4.新型隐球菌感染以Th2应答占优势,巩固期免疫应答状态向Th1漂移,这可能是新型隐球菌发生免疫逃逸,从而导致新型隐球菌性脑膜炎发生的原因之一。VAD1作为重要的毒力决定因子,其发挥作用可能与其所致的Th偏移有关。