白三叶（Trifolium repens）是豆科三叶草属的一种优良多年生草种,因其具有产量高、牧草品质优良、生物固氮能力强等特点,成为世界各地广泛栽培的豆科牧草,亦被应用于观赏性草坪。然而,白三叶喜冷凉湿润气候,抗旱、耐热性差,干旱成为限制其生产利用的主要逆境胁迫因子。外源添加是一种操作简单、见效快的提高植物抗旱性的方法。壳聚糖（Chitosan,CTS）是一种无毒、无污染的动物源激素,由于其对环境的友好性,被广泛应用于农业生产,其提高植物抗病性与促进内源脱落酸合成相关。多胺（Polyamine,PA）是植物体内广泛存在的生长调节剂,它可以通过与激素互作,增强抗氧化保护能力和光合作用等来提高植物抗旱性。本文将研究在干旱胁迫下,外源CTS和精胺（Spermine,Spm）对白三叶内源PA代谢、激素水平变化以及抗氧化系统的影响,从生理角度揭示CTS调控白三叶抗旱性机制。结合GC-MS和LC-MS技术,分析外源CTS对白三叶差异表达代谢物的影响,不仅能从代谢角度揭示CTS诱导白三叶的抗旱机制,而且可以为联合分析挖掘抗旱基因提供代谢组学数据。通过转录组学分析CTS对白三叶基因表达调控及与抗旱性提高相关的代谢通路,从分子层面揭示CTS提高白三叶抗旱的机制,可以为联合分析挖掘抗旱基因提供转录组学数据。通过联合分析代谢组和转录组数据,挖掘与CTS提高白三叶抗旱性相关的代谢物和基因。初步分析受CTS调控且与多胺合成相关的S-腺苷甲硫氨酸合成酶（S-adenosylmethionine synthetase,SAMS）基因在抗旱中的作用,确认SAMS基因是否与抗旱相关。主要研究结果如下:1.外源添加CTS或Spm,可以显著促进白三叶内源PA积累,这种积累是通过上调ADC、SAMDC以及下调Cu AO、PAO的活性及其基因表达实现的;还可以调控内源激素ABA、CTK、GA和IAA。内源PA和激素含量的变化,一方面提高了干旱胁迫下白三叶抗氧化酶活性及其基因表达水平;另一方面,还可以促进总酚和类黄酮的积累。由于上述的调节作用,使得O2·-、H2O2、MDA和EL含量降低,由此可见,外源添加CTS或Spm均可以有效的缓解干旱胁迫诱导产生的伤害。此外,共同添加CTS和Spm比单一使用更为有效。2.利用GC-MS和LC-MS技术进行代谢组学分析发现,干旱条件下外源添加CTS可导致白三叶体内代谢模式发生变化。通过GC-MS技术主要鉴定出碳水化合物、氨基酸、有机酸和一些其他代谢物,而LC-MS技术则主要鉴定出氨基酸、有机酸、次生代谢物和一些其他代谢物。外源CTS通过促进抗旱相关代谢物的积累,提高了胁迫下渗透调节和抗氧化防御能力、维持了能量代谢、缓减了胁迫诱导的氧化性伤害并稳定了细胞膜,从而在提高白三叶抗旱性中发挥重要作用。3.通过转录组分析发现,可被注释的Unigenes为51932个,其中,超过一半的转录本（57.9%）注释到蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）上,21.1%注释到大豆（Glycine max）上。COG功能注释中,转录（transcription）、翻译,核糖体结构和生物起源（translation,ribosomal structure and biogenesis）以及复制重组和修复（replication recombination and repair）所占比例最高。（P+CTS）/P中分别有2460和1124个差异表达基因被上调和下调,其中748和818个基因被注释。外源CTS对干旱下白三叶差异表达基因的影响涉及到许多代谢通路,例如类黄酮代谢通路、ASA和GSH合成通路、光合代谢通路和核糖体蛋白通路。4.共惯性分析发现Unigenes和代谢物之间具有很强的相关性,前两个共有组分的总变差为82.6%,且四个实验组可以明显的被区分开。在关联到的29个主要的代谢通路中,碳水化合物和氨基酸代谢在CTS调节的白三叶抗旱性中发挥了重要的作用。在干旱胁迫下,外源添加CTS会调控这些代谢中的部分关键基因,如β-葡糖苷酶基因、鸟氨酸转氨酶基因（OTC）、氨基丁酸氨基转移酶基因（GABA-T）和与多胺合成相关的亚精胺合成酶基因（SPDS）、SAMS、鸟氨酸脱羧酶基因（ODC）。综上,CTS调控的白三叶抗旱性与上述通路或者基因密切相关。5.通过同源获取及RACE扩增,得到白三叶SAMS全长序列。通过生物信息学分析发现,Tr SAMS编码的蛋白有三个保守结构域,为稳定、亲水蛋白,无跨膜结构,定位在细胞核中。通过对Tr SAMS表达模式分析发现,Tr SAMS可以被非生物胁迫、激素及信号诱导,且在根和叶中的表达具有一定的差别。与野生型相比,过表达Tr SAMS的拟南芥植株内源多胺水平增高,生长及抗旱性增强。综上所述,（1）CTS或Spm可促进干旱胁迫下白三叶内源PAs和激素积累,增强抗氧化防御能力,有效的缓解干旱胁迫诱导产生的伤害。此外,共同添加CTS和Spm比单一使用更为有效;（2）基于GC-MS和LC-MS技术发现,CTS可以诱导干旱条件下白三叶碳水化合物、氨基酸、有机酸、次生代谢物和一些其他代谢物的积累,从而调节胁迫下渗透调节能力、抗氧化代谢、能量代谢、碳平衡和利用、线粒体呼吸作用驱动ATP合成等多种功能,最终在抗旱性上发挥作用;（3）转录组学分析显示,CTS通过调节许多代谢通路中的关键基因,例如类黄酮、ASA和GSH合成通路、光合代谢通路、核糖体蛋白通路,提高胁迫下渗透调节能力、维持能量代谢、增强抗氧化防御,缓减胁迫诱导的氧化性伤害并稳定细胞膜,提高白三叶的抗旱性;（4）使用共惯性分析发现,Unigenes和代谢物之间具有很强的相关性,其中碳水化合物和氨基酸代谢在CTS调节白三叶抗旱性中起重要作用,另外与多胺合成相关的基因SPDS、SAMS、ODC被显著调节;（5）Tr SAMS有三个保守结构域,为稳定、亲水蛋白,无跨膜结构,定位在细胞核中,可被非生物胁迫、激素及信号诱导。与野生型相比,过表达Tr SAMS拟南芥植株的内源多胺水平增高,生长能力和抗旱性增强。