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背景神经母细胞瘤(neuroblastoma,NB)为一种肾上腺起源的肿瘤,是新生儿发病率较高的癌症。有大约50%的NB的发生是在2岁以内的婴幼儿时期,NB占儿童肿瘤的比例约为6-10%,致死率约为15%。NB是一种神经源性恶性肿瘤,NB细胞在体内和体外培养中,都出现了分化成神经细胞和神经胶质细胞的现象,因此将NB细胞作为一种细胞模型研究肿瘤分化和凋亡及其机制具有重要意义。目前国内外采用较多的用于研究肿瘤的生长、分化、凋亡等机制的NB细胞系主要有SH-SY5Y、SK-N-SH、SK-SN-BE2、LA-N-5等。而我们实验采用的NB细胞SH-SY5Y、SK-N-SH能够支持质粒的复制,使克隆的基因片段得到高效的表达,可表达神经元标志性物质,其细胞形态及其某些生理功能与正常神经元有相似之处,是目前国际上研究神经细胞功能比较理想的细胞模型。PCNP(PEST-containing nuclear protein)是一种新近发现的含有PEST序列的核蛋白,PCNP作为泛素连接酶NIRF(Np95/ICBP90-like RING figer protein)的底物首次于2004年由日本科学家侧面报道,PCNP和NIRF一起构成一种新的信号转导通路,与细胞周期的调控和增殖有着紧密的联系。PCNP是一种指环状的蛋白,它主要定位于细胞核中,它作为一种蛋白连接酶,具有泛素化能力,可以在蛋白降解中起作用。目前关于PCNP的相关报道较少,但关于PEST结构域的研究相对较多,PEST是一种富含脯氨酸(Proline,P)、谷氨酸(Glutamic acid,E)、丝氨酸(Serine,S)和苏氨酸(Threonine,T)的肽序列,PEST domin对于细胞周期和增殖具有调控作用,并且和染色体的稳定、肿瘤的发生以及免疫系统疾病有关。因此我们猜想并验证PCNP也与细胞生长和凋亡有关,本课题对PCNP对于人神经母细胞瘤细胞生长及凋亡的影响做了初步探讨。目的探讨PCNP基因过表达及沉默对人NB细胞增殖、迁移、侵袭和成瘤的影响,并寻找可能导致这些变化的机制。方法将PCNP过表达及干扰质粒转染人NB细胞SH-SY5Y和SK-N-SH,并分别采用G418和嘌呤霉素筛选得到稳定转染细胞株,将得到的稳定株采用MTS、EDU法检测细胞增殖;采用TUNEL染色法检测细胞凋亡水平变化;采用划痕、transwell、invasion、soft agar实验检测细胞迁移和侵袭能力;并通过蛋白免疫印迹法Western blot检测MAPK及PI3K/AKT/mTOR通路相关分子表达的变化;将PCNP过表达及沉默的人NB细胞注射入裸鼠腋下检测PCNP对人NB细胞成瘤能力的影响。结果(1)成功构建PCNP过表达及沉默稳定株;(2)MTS、EDU检测SH-SY5Y细胞和SK-N-SH细胞增殖情况,结果显示PCNP过表达抑制细胞增殖,沉默促进细胞增殖;(3)Tunel染色法检测细胞凋亡,结果显示PCNP过表达促进NB细胞凋亡,沉默抑制凋亡;(4)划痕和transwell法检测PCNP对NB细胞迁移能力的影响,结果表明PCNP过表达后细胞迁移能力减弱,沉默后增强;(5)invasion和soft agar实验检测细胞侵袭能力,结果表明PCNP过表达减弱NB细胞侵袭能力,而PCNP沉默侵袭增强;(6)Western blot结果显示PCNP过表达后Cleaved Caspase3、Cleaved Caspase8、Cleaved Caspase9表达增多,而PCNP沉默后表达减少;PCNP过表达导致SH-SY5Y细胞bax表达增多,bcl-2表达减少;相反PCNP沉默导致细胞bax表达减少,bcl-2表达增加,与凋亡实验结果一致;因此PCNP可能通过调控细胞凋亡而影响生长;(7)Western blot检测MAPK及PI3K/AKT/mTOR信号通路相关分子表达的变化,结果显示PCNP过表达后p-JNK、p-P38和p-Erk表达增多,而磷酸化的PI3K、AKT、mTOR与对照相比表达减少;而PCNP沉默后磷酸化的JNK、P38和Erk表达减少,磷酸化的PI3K、AKT、mTOR表达增多,因此PCNP可能通过MAPK信号转导通路调控NB细胞凋亡,通过PI3K/AKT/mTOR通路调控NB增殖;(8)注射PCNP过表达细胞的裸鼠腋下肿瘤较对照组减小,注射PCNP沉默细胞的裸鼠腋下形成的肿瘤较对照组增大。结论1、PCNP抑制人NB细胞SH-SY5Y和SK-N-SH增殖;2、PCNP促进人NB细胞凋亡;3、PCNP抑制人NB细胞迁移和侵袭;4、PCNP可能通过MAPK信号转导通路和PI3K/AKT/mTOR通路调控细胞凋亡及增殖;5、PCNP抑制人NB细胞移植瘤形成。