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目的：探讨miR-34a能否通过HMGB1调控视网膜母细胞瘤细胞的凋亡及自噬,并增加DNA的损伤以提高化疗药物对视网膜母细胞瘤的治疗效果。方法：培养人视网膜母细胞瘤细胞Y79及Weri-RB1后分四部分完成本实验研究。1.miR-34a调节RB细胞HMGBl的表达：Y79及Weri-RB-1细胞转染miR-34a mimic或antagomir-34a后,qRT-PCR及Western-blotting分别检测HMGB1mRNA及蛋白表达水平改变,萤光素酶检测分析HMGB13’UTR报告基因活性改变。2.miR-34a通过调节HMGBl诱导凋亡并抑制自噬：Y79细胞转染miR-34a mimic、HMGB1shRNA或同时转染miR-34a和pUNO1-HMGB1cDNA72小时后Caspase3试剂盒及Annexin V/FITC试剂盒检测细胞凋亡及Caspase3活性,Western-blotting分析cleaved-cap3及cleaved PARP蛋白水平改变。Y79细胞转染miR-34a mimic或]HMGB1shRNA72小时后HBSS饥饿培养1小时,Western-blotting检测LC3、p62及HMGB1蛋白水平改变,免疫荧光观察并计数LC3点状聚集改变,透射电镜观察并计数自噬空泡数量改变。3.miR-34a通过抑制自噬增强RB细胞对化疗的敏感性：Y79细胞经长春新碱、依托泊苷或卡铂处理48小时后Western-blotting检测LC3及p62的蛋白水平。Y79细胞分别转染1miR-34a mimic、HMGB1shRNA、Beclin shRNA及Atg5shRNA72小时后长春新碱、依托泊苷或卡铂处理48小时,计数LC3点状聚集数并检测细胞生存能力。4.miR-34a通过抑制自噬增加RB细胞化疗后DNA的损伤：Y79细胞分别转染miR-34a mimic、HMGB1shRNA及Atg5shRNA后依托泊苷或卡铂处理48小时,Western-blotting检测γ-H2AX蛋白水平,Annexin V/FITC凋亡试剂盒检测凋亡水平改变。在Atg5基因干扰的细胞加入NAC再经依托泊苷或卡铂处理48小时,Western-blotting观察γ-H2AX蛋白及凋亡水平改变。结果：Y79细胞和Weri-RB1细胞在转染miR-34a mimic后HMGB1的mRNA水平、蛋白表达及3’UTR报告基因活性均下降,相反抑制miR-34a后HMGB1的mRNA水平、蛋白表达及3’UTR报告基因活性提高。转染mir-34a mimic或HMGB1shRNA后,Y79细胞的凋亡水平及Caspase3活性均明显提高,反映蛋白裂解水平的cleaved Cap3及cleaved PARP表达也增加。而通过转染pUNO1-HMGB1促使HMGB1过表达可以抑制由miR-34a mimic诱导的凋亡、Caspase3活性及cleaved PARP表达。HBSS饥饿培养Y79细胞后HMGB1的mRNA在1-2小时内增加,后逐渐下降至基线水平,而miR-34a一直处于增加状态。通过增加miR-34a或减少HMGB1能抑制由饥饿诱导的LC3II表达及LC3点状聚集,而使用溶酶体蛋白酶抑制剂E/P后可以恢复miR-34a mimic转染细胞内的LC3Ⅱ的表达水平。超微结构检查发现miR-34a mimic可以减少由饥饿产生的自噬空泡。Y79细胞在经过长春新碱、依托泊苷或卡铂治疗后,LC3Ⅱ表达水平增加而p62下降。通过观察LC3点状聚集可以发现miR-34a mimic及HMGB1shRNA抑制了由长春新碱、依托泊苷或卡铂诱导的自噬,但增加了化疗药物对RB的作用效果。通过抑制自噬重要的调节因子Beclin1和Atg5也可以达到增加化疗效果的作用。Y79细胞经依托泊苷或卡铂治疗后可以反映DNA损伤的γ-H2AX蛋白表达升高。miR-34a mimic、HMGB1shRNA及Atg5shRNA均可增加由化疗诱导的凋亡及γ-H2AX表达水平。而抗氧化剂NAC可以减少由依托泊苷或卡铂诱导的DNA损伤。结论：HMGB1是miR-34a在RB细胞内的作用目标之一。miR-34a可以减少]HMGB1的mRNA水平以促进RB细胞的凋亡并抑制自噬,通过增加细胞DNA的损伤来提高化疗药物对RB细胞的治疗效果,为临床治疗RB提供新的思路及方法。