论文部分内容阅读
目的:筛选出能够高效特异性沉默自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)阴茎海绵体平滑肌细胞1-磷酸鞘氨醇受体3(sphingosine-1-phosphate receptor 3,S1PR3)基因表达的siRNA慢病毒载体,并观察其对SHR阴茎海绵体平滑肌细胞ROCK1、ROCK2、eNOS表达的影响[1]。方法:以大鼠S1PR3基因mRNA序列作为干扰靶点,设计并合成3对靶向S1PR3的siRNA序列(siRNA1、siRNA2、siRNA3)及1对阴性对照序列,构建并包装成慢病毒载体[1]。体外培养SHR阴茎海绵体平滑肌细胞及魏-凯二氏大鼠(Wistar-Kyoto rats,WKY)阴茎海绵体平滑肌细胞,随机分为A组(SHR对照组)、B组(携带阴性对照病毒的SHR阴茎海绵体平滑肌细胞转染组)、C~E组(分别携带靶向S1PR3基因siRNA1~3号靶点慢病毒的SHR阴茎海绵体平滑肌细胞转染组)、F组(WKY对照组),以感染复数(MOI)=60转染SHR阴茎海绵体平滑肌细胞,转染72h后观察细胞绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的表达情况,并用RT-PCR和Western blotting检测转染后细胞中S1PR3、ROCK1、ROCK2、eNOS mRNA及蛋白的表达情况[1]。结果:经基因测序证明合成的携带S1PR3基因siRNA 1~3号靶点的寡核苷酸链序列插入正确。荧光显微镜下观察发现携带靶向S1PR3的siRNA慢病毒载体及阴性对照病毒载体均能有效转染SHRCCSM细胞,且转染效率均>80%[1]。C、D、E、F组的S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达较A组下降(p<0.05),其中E组抑制作用最为明显,使S1PR3基因mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(34.2±2.9)%、(77.7±4.7)%;ROCK1基因mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(33.3±1.4)%、(51.1±7.3)%;ROCK2基因mRNA及蛋白表达的抑制效率分别为(30.8±3.6)%、(58.32±5.5)%。S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达在A组与B组之间均无明显改变,A组eNOS基因mRNA及蛋白表达分别与B、C、D、E比较,无明显差别,但较F组显著降低(p<0.01);与F组比较,E组S1PR3、ROCK1、ROCK2 mRNA及蛋白的表达均无明显差别,A、B、C、D组的S1PR3、ROCK1、ROCK2基因mRNA及蛋白表达高于F组(p<0.05),A、B、C、D、E组eNOS基因mRNA及蛋白表达较F组显著降低(p<0.01)[1]。结论:本研究构建的3条携带不同位点的S1PR3基因的siRNA慢病毒载体均能够显著抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞S1PR3基因的表达,并能有效的抑制SHR阴茎海绵体平滑肌细胞中上调的RhoA/Rho激酶信号通路,其中携带siRNA3慢病毒载体的抑制效率最高[1]。