研究背景与目的通过激活自身免疫系统的肿瘤免疫治疗越来越受到关注,它能抑制很多种人类恶性肿瘤细胞而又不影响正常细胞。固有免疫产生于系统发育的早期和宿主免疫应答的初级阶段,调节适应性免疫应答是固有免疫最重要的功能,目前认为它不具有免疫记忆功能。有研究显示鼠自然杀伤细胞(NK细胞)的一个特殊亚群对各种各样的抗原能形成长久且特异性强的记忆功能。NK细胞是不同于T、B淋巴细胞的大颗粒细胞,分布于外周各淋巴器官及血液循环系统,无需抗原的预先刺激与活化即可发挥细胞毒效应,并可分泌多种细胞因子。NK细胞表达一系列活化性受体和抑制性受体,两者间的平衡是控制NK细胞是否被激活的重要机制。正常情况下,靶细胞表而自身MHC I类分子与NK细胞表面抑制性受体结合传导抑制性信号,从而抑制NK细胞功能,靶细胞不会受到NK细胞的攻击。病理状态下,这种平衡被打破,NK细胞即可能对靶细胞行使“killing’效应。研究表明,经过外源性DNA预处理的肿瘤来源细胞能促进固有或适应性免疫应答,进而诱导肿瘤细胞凋亡。如插入免疫激活基因能刺激NK细胞的抗肿瘤免疫应答,提示外源DNA能作为免疫治疗及细胞毒作用的刺激因子。次要组织相容性抗原基因HA-1特异地表达在造血细胞中,能识别HA-1的杀伤性T细胞,有明显的抗白血病效应；AML/ETO是急性髓系白血病-M2型特异性融合基因。HA-1和AML/ETO在白血病的形成中起重要作用。活菌载体疫苗是将异源抗原基因插入活细菌的染色体或质粒载体中,激发免疫系统提呈异源抗原并产生免疫保护,从而达到预防一种或多种疾病的新型疫苗。活菌载体疫苗不但能诱发机体产生体液免疫,而且能产生细胞免疫和黏膜免疫应答。一直以来,以沙门氏菌(Salmonella)为载体的菌株是此类疫苗载体研究的一个热点。伤寒沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhi)是一种对人专性致病的野生毒株,具有很强的免疫原性和反应原性。它是一种常见的侵袭性胞内菌,通过基因工程方法减毒后对宿主致病性显著降低,但仍保留良好的侵袭力,可将免疫抗原直接递呈给免疫细胞而诱导特异性的免疫应答反应,减毒鼠伤寒沙门氏菌作为口服疫苗载体是目前疫苗免疫研究的热点之一基于以上研究结果和理论,本研究构建AML/ETO及HA-1的重组质粒,将免疫原型基因AML/ETO及HA-1的重组质粒转化到减毒沙门氏菌,构建重组沙门氏菌疫苗,以此疫苗侵染AML/ETO阳性的急性白血病Kasumi-1细胞,体外实验观察NK细胞对疫苗侵染的Kasumi-1细胞具有杀伤作用。此外,通过不同的预处理方案,抑制BALB/c裸鼠免疫系统,将AML/ETO阳性的急性白血病Kasumi-1细胞接种到预处理的裸鼠中,构建低成本、高稳定性的裸鼠模型。拟用我们构建的重组沙门氏菌疫苗侵染此白血病裸鼠模型,进一步研究该疫苗在体内的抗白血病效应。实验方法第一部分重组沙门氏菌疫苗增强NK细胞对急性白血病细胞的固有免疫应答1、HA-1及AML/ETO重组质粒的构建及重组沙门氏菌疫苗的建立将克隆出来的长约208bp的AML/ETO片段分别插入到含长片段(HA-1F)及短片段的(HA-1M)HA-1片段的质粒中,采用电穿孔法将含AML/ETO. HA-1M.HA-1F.AML/ETO+HA-1M.AML/ETO+HA-1F片段的5个重组质粒转化到已制备好的沙门氏菌感受态中,空载作为对照组。测序分析目的基因在重组质粒中正常连接。2、急性髓系白血病M2型Kasumi-1细胞的培养及重组沙门氏菌疫苗的侵染Kasumi-1细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中培养,PBS洗涤后用不含抗性的新鲜培养基重悬,使细胞密大约为2×105/mL,按细胞与沙门氏菌SL7207比例为1：15在37℃孵箱共孵育2h后,用庆大霉素抑制胞外菌。感染48h后,透射电子显微镜检测细胞超微结构,证实重组沙门氏菌侵染成功。3、NK细胞的培养淋巴分离液常规分离健康人外周单个核细胞,贴壁1h后,Hank平衡盐溶液(HBSS)洗涤,贴壁的细胞培养过夜,换上NK-92专用培养基,培养72h后,CD56+CD16+NK细胞分离试剂盒分离NK细胞。按照不同的效靶比分别将NK细胞与被重组沙门氏菌疫苗侵染的Kasumi-1细胞共孵育,3000rpm离心收集上清,采用乳酸脱氢酶法进行细胞毒性功能测定,比较NK细胞对携带不同基因的重组沙门氏菌疫苗侵染Kasumi-1细胞的杀伤力。4、细胞毒性测定NK细胞与感染沙门氏菌疫苗的Kaumi-1共孵育后收集上清,细胞毒T细胞(CTL)功能测定采用乳酸脱氢酶法,参照Promega公司的非放射性细胞毒检测试剂盒说明进行。每孔取50μ1上清液检测LDH的释放,以490nm波长测定吸光度(A)值,按说明书计算。细胞毒性百分比计算公式：%细胞毒性百分比=(OD实验释放-OD效自发释放-OD靶自发释放)/(OD靶最大释放-OD靶自发释放)×100。第二部分建立人急性粒细胞白血病M：裸鼠模型1、裸小鼠白血病移植瘤模型的建立将BALB/c裸鼠以抽签法随机分3组：环磷酰胺组腹腔注射环磷酰胺连续2d后,尾静脉注射Kasumi-1细胞8×105/只；照射组给予3Gy X射线全身照射,照射当天尾静脉注射Kasumi-1细胞；无预处理组未作任何处理,尾静脉注射Kasumi-1白血病细胞。另取3只王常BALB/c裸鼠作为王常对照。2、RT-PCR检测白血病细胞瘤负荷经上述实验检测发现裸鼠接种Kasumi-1细胞后14d成瘤。取接种瘤细胞28d的裸鼠眼眶静脉血.0.5ml,提取total RNA,鉴定total RNA的纯度及完整性。设计引物AML1-A:CTA CCG CAG CCA TGA AGAACC:ETO-B:AGA GGA AGG CCC ATT GCT GAA,产物大小395bp。PCR条件：95℃,30s；35个循环(94℃,30s;65℃,lmin;72℃,1min)：72℃,3min,。凝胶成像分析系统进行成像分析。3、FISH检测模型鼠骨髓AML/ETO融合基因阳性细胞百分比收集各时间点处死小鼠的骨髓细胞,在荧光原位杂交仪59℃烤片2h,加入稀释好的DNA探针,盖上盖玻片并Rubber Cement封片,75℃变性2min,37℃杂交过夜。小心揭去盖玻片,洗涤,室温自然干燥,加入DAPI/Antifade避光复染20min后,荧光显微镜下观察及采集图像。统计学方法所有实验数据以均数±标准差表示,用SPSS13.0软件进行分析,在同一效靶比的前提下,同一效靶比、不同重组疫苗组间的细胞杀伤力的比较采用单因素方差分析,如果方差齐多重比较采用LSD方法检验,若方差不齐多重比较采用Dunnett’s T3,P<0.05被认为之间差异具有统计学意义。再采用分析出来的杀伤力最好的该种疫苗,通过如上述相同的统计学方法比较不同效靶比间细胞杀伤力,从而得出效靶比及重组疫苗组合最优的方法。实验结果第一部分重组沙门氏菌疫苗增强NK细胞对急性白血病细胞的固有免疫应答1、成功构建携带双基因的重组质粒经琼脂糖凝胶电泳证实PCR扩增出含不同酶切位点的AML-ETO1和AML-ETO2基因,PCR产物经纯化酶切后分别连接在pcDNA3.1-HA-1H(含HA-1M短片段)及pEXP-cDNA3.1-HA1-H-mycHIS-Neo-Jos(含HA-IF长片段)质粒上,将连接产物pcDNA3.1-HA-1H-AML-ETO1(含HA-1M短片段)及pEXP-cDN A3.1-HA1-H-mycHIS-Neo-Jos-AML-ET02转化到已制备好的DH5α感受态中,挑选培养皿上的单克隆菌经PCR鉴定后,阳性克隆送交公司测序,测序结果示AML-ETO基因已分别正确连到相应的质粒中,且测序序列与原序列完全一致。2、重组疫苗菌株的构建和成功鉴定分别将空白对照组及五种质粒pUHD-HA-AML1-ETO, pcDNA3.1-HA-1M, pEXP-cDNA3.1-HA1-H-mycHIS-Neo-Jos, pcDNA3.1-HA-1M-AML-ETO1pEXP-cDNA3.1-HA1-H-mycHIS-Neo-Jos-AML-ETO2转化到已经制备好的沙门氏菌SL7207感受态中,PCR电泳及DNA测序证实转化成功。3、透射电镜检验重组沙门氏菌疫苗侵染Kasumi-1细胞成功用同样的方法分别将对照组沙门氏菌SL7207及五种重组疫苗菌SL7207/pUHD-HA-AML1-ETO,SL7207/pcDNA3.1-HA-lM,SL7207/pEXP-cDNA3.1-HA1-H-mycHIS-Neo-Jos,SL7207/pcDNA3.1-HA-1M-AML-ETO1SL7207/pEXP-cDN A3.1-HA1-H-mycHIS-Neo-Jos-AML-ETO2,侵染急性髓系白血病Kasumi-1细胞2天后,收集细胞,选未被侵染的Kasumi-1细胞为对照组,重组疫苗SL7207/pEXP-cDNA3.1-HA1-H-mycHIS-Neo-Jos-AML-ETO2为实验组进行透射电镜检测,结果显示：沙门氏菌疫苗侵染细胞后,细胞胞浆出现小泡,而对照组则无,提示重组沙门氏菌侵染Kasumi-1细胞成功。4、细胞毒性测定按照效应细胞：靶细胞比为8：1、16：1、32：1将NK细胞与感染沙门氏菌的Kasumi-1共孵育后,离心取50μl上清液与50μl CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxieity Assay试剂盒Substrate Mix反应液混合,测定混合物中的乳酸脱氢酶释放量。细胞毒性百分比计算公式：细胞毒性百分比=(OD实验释放-OD效自发释放-OD靶自发释放)/(OD靶最大释放-OD靶自发释放)×100%。经One-Way ANOVA统计方法分析得出,当效靶比为8：1时,与对照组相比(P<0.05),携带有AML/ETO基因和/或HA-1基因的重组沙门氏菌疫苗,能增强NK细胞的杀伤力,而尤以同时携带AML/ETO基因和HA-1M基因的重组沙门氏菌疫苗侵染Kasumi-1细胞,更能激活NK细胞杀伤力(P<0.05);当效靶比为16：1时,至少携带一个HA-1基因的重组沙门氏菌疫苗侵染组NK杀伤力高于AML-ETO单基因侵染组及对照组(P<0.05),且同样以同时携带AML/ETO基基因和HA-1M基因的疫苗侵染组效果最好(P<0.05)；而效靶比为32：1时,携带双基因重组沙门氏菌疫苗侵染组的NK杀伤力高于单基因组及对照组(P<0.05),结果仍以携带AML-ETO和HA-1M双基因疫苗侵染组杀伤力最高(P<0.05)；当聚焦在同时携带AML-ETO和HA-1M双基因的SL7207/pcDNA3.1-HA-1M-AML-ETO1重组沙门氏菌疫苗侵染组时发现,NK细胞效靶比为32：1时,NK细胞杀伤效果最好。综上所述,NK细胞与重组沙门氏菌疫苗SL7207/pcDNA3.1-HA-1M-AML-ETO1侵染的Kasumi-1细胞效靶比为32：1时,NK细胞杀伤力最大第二部分建立人急性粒细胞白血病M：裸鼠模型1、发病情况裸鼠在接种Kasumi-1细胞14d后均发生白血病,表现为裸鼠萎糜少动,腹部膨隆,皮下可触及大小不等的结节,随肿块增大体量减轻,42d后部分小鼠出现步态不稳,侧偏或转圈。2、白血病模型鼠外周血AML/ETO基因mRNA水平正常对照组裸鼠外周血单个核细胞未发现有Kasumi-1细胞特有融合基因AML/ETO。不磷酰胺预处理组、X射线照射预处理组、未进行预处理组均可见融合基因AML/ETO的mRNA表达,但无预处理组电泳条带弱于环磷酰胺组、3Gyx射线照射组。3、白血病模型鼠骨髓AML/ETO基因阳性细胞的出现小鼠细胞明显小于人源肿瘤细胞,同时仅有DAPI核染色。正常对照组裸鼠骨髓细胞未发现有Kasumi-1细胞特有融合基因AML/ETO.实验的3个组在接种Kasumi-1细胞4周后,在骨髓单个核细胞中发现融和基因AML/ETO的杂交信号。实验结论1、成功构建总共6种携带AML/ETO和/或HA-1单基因或双基因重组沙门氏菌疫苗；2、证实在急性髓系白血病M2型Kasumi-1细胞中,与对照组相比,携带单基因及双基因的重组沙门氏菌疫苗能增强NK细胞的自然杀伤作用：3、证实NK细胞对携带AML/ETO和HA-1M双基因重组沙门氏菌疫苗侵染的Kasumi-1细胞杀伤效应优于其他任何一种重组沙门氏菌疫苗组,且以效靶比为32：1杀伤效应最优;4、成功的建立人急性粒细胞白血病M2裸鼠模型；5、证实跟空白对照组相比,两组预处理组及未进行预处理组均能成瘤。6、成功构建急性髓系白血病M2裸鼠模型,为进一步研究我们构建的AML/ETO及HA-1M双基基因重组沙门氏菌疫苗在体内的抗白血病效应打下基础。