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研究背景原发性干燥综合征（primary Sj?gren syndrome,p SS）是一种主要累及外分泌腺的慢性炎症性自身免疫病。病理特点为唾液腺和泪腺等外分泌腺组织存在淋巴细胞浸润。迄今为止,p SS确切的发病机制仍不清楚。同时p SS的临床治疗尚未有突破性进展。虽然一些靶向治疗药物（如B细胞耗竭剂、B细胞活化因子抑制剂和靶向共刺激信号分子或促炎细胞因子的药物）已经相继问世,成为p SS的潜在治疗药物。但是这些药物的临床疗效仍有待证实。美国食品药品监督管理局和欧洲药品管理局尚未批准任何生物制剂治疗p SS,针对该疾病的治疗手段仍然十分有限。p SS病变部位主要是唾液腺。唾液腺淋巴细胞浸润形成的免疫微环境是导致p SS自身免疫发生发展的关键因素。因此,深入探究p SS唾液腺微环境和细胞之间的相互作用,有助于我们更好的理解p SS的发病机制,为药物开发提供更有价值的作用靶点。然而p SS唾液腺局部炎症微环境中存在哪些细胞组分以及他们发挥怎样的功能目前尚不明确。单细胞RNA测序（Single-cell RNA sequencing,sc RNA-seq）是一项新兴技术,可以在单细胞水平分析转录组特点,适用于探究复杂的组织微环境与细胞的异质性。该技术已广泛应用于风湿病的发病机制研究,可以协助识别新的细胞亚群,阐明细胞分化轨迹和免疫致病机理等,是一种解析p SS发病机制的强有力手段。研究目的利用sc RNA-seq构建p SS唾液腺单细胞图谱,明确p SS唾液腺微环境特征以及上皮细胞、免疫细胞和基质细胞在p SS发生和发展中的作用和机制,探究细胞间的相互作用关系,为p SS发病机制研究和临床药物开发提供新的理论支持。研究方法（1）本研究收集了10例p SS患者和5例对照者的唇腺（labial salivary gland,LSG）组织,以及2例p SS患者和2例对照者的腮腺组织。用复合酶消化组织样本,制备成单细胞悬液,并利用10X genomics平台进行sc RNA-seq。（2）利用Seurat软件对sc RNA-seq数据进行降维和聚类分析,根据细胞类型标志性基因鉴定各细胞成分。分别从亚群比例、基因表达和通路激活等角度,探究p SS唾液腺炎症微环境中的细胞亚群比例以及分子、通路的改变。重点阐述了上皮细胞亚群、免疫细胞亚群和基质细胞亚群在p SS发病的不同作用。（3）利用Cellphone DB软件全面构建p SS唾液腺细胞间的通讯网络,展现p SS唾液腺微环境特有的细胞间通讯方式。重点分析p SS上皮细胞亚群和免疫细胞亚群的关键通讯分子。（4）采集p SS和正常人的血清和唾液腺组织,并使用免疫组织化学、免疫荧光和酶联免疫吸附实验等方法对关键靶分子和通路作进一步的验证。研究结果（1）通过单细胞数据的质控,获得了125957个LSG细胞数据和32437个腮腺细胞数据,构建了目前国际上最大规模的p SS唾液腺单细胞图谱。通过对sc RNA-seq数据进行降维和聚类,在LSG中鉴定出14个细胞亚群,在腮腺样本中鉴定出12个细胞亚群。p SS患者LSG中T细胞、B细胞、浆细胞和内皮细胞比例显著增加,与病理分级呈正相关。（2）p SS LSG导管细胞、浆液性腺细胞和粘液性腺细胞中共鉴定出9个细胞亚群。炎症性导管细胞和炎症性腺泡细胞具有较强的免疫激活能力,分泌型腺泡细胞有较强的唾液分泌功能。p SS患者炎症性导管和腺泡细胞增多而分泌型腺泡细胞减少,导致p SS导管和腺泡免疫活化能力增强,唾液分泌能力下降。生物学功能富集分析发现病毒感染通路、抗原提呈通路、自身免疫通路和炎症反应通路在p SS患者中激活,主要集中于炎症性导管和炎症性腺泡细胞。（3）p SS LSG免疫细胞共鉴定出11个细胞亚群。其中,CD8+T细胞、CD4+T辅助细胞（T helper,Th）、Th17、滤泡辅助性T细胞（Follicular helper T cells,Tfh）、B细胞和浆细胞相比对照组比例增加。p SS患者Tfh和Th17共刺激分子表达上调;CD8+T细胞毒性作用增强;M1巨噬细胞和记忆B细胞抗原提呈能力增强。这些改变共同促进p SS自身免疫形成。通过全面分析p SS炎症微环境中免疫细胞表达炎症细胞因子的情况,发现Tfh表达的CXCL13和IL21,CD8+T细胞表达的IFNG和TNFSF9,记忆B细胞表达的IL7以及巨噬细胞表达的趋化因子和内皮生长因子在p SS患者中均显著增加。（4）p SS LSG基质细胞共鉴定出5个细胞亚群。其中,内皮细胞比例增加,基底细胞比例减少。通过差异基因分析发现p SS内皮细胞中的趋化因子和黏附分子表达增加。肌上皮细胞角质蛋白表达增加,收缩分子表达下降。生物学功能富集分析表明p SS基质细胞NOD2信号通路和炎症小体信号通路激活,并且主要富集于内皮细胞。（5）p SS唾液腺微环境细胞间通讯作用相较与健康对照更密切。表现为上皮细胞和免疫细胞的互作显著增强。CD74是p SS上皮细胞和免疫细胞通讯的关键分子,在炎症性上皮细胞中和MAPK信号通路显著正相关,并且和磷酸化MAPK（ERK1/2）呈分子共定位。研究结论本课题构建了p SS唾液腺单细胞图谱,明确了p SS唾液腺微环境的细胞亚群构成以及它们在p SS发病中作用。我们发现炎症性上皮细胞亚群比例在p SS比例显著增加,进而促进了免疫激活,可能是关键的致病性上皮细胞亚群。Tfh和Th17共刺激分子上调和记忆B细胞抗原提能力上调促进p SS自身免疫形成。Tfh表达的CXCL13和IL21,CD8+T细胞表达的IFNG和TNFSF9,记忆B细胞表达的IL7以及巨噬细胞表达的趋化因子和内皮生长因子促进p SS炎性微环境形成和自身免疫反应。内皮细胞的固有免疫通路激活在p SS疾病进展中扮演重要角色。CD74介导p SS上皮细胞和免疫细胞的相互作用,可能和MAPK通路协同促进上皮细胞免疫活化和炎症性损害,为p SS的治疗提供新的潜在靶点。