熊胆粉是一种珍贵的传统中药材，在我国已有上千年的药用历史，临床上主要用来治疗与胆汁酸代谢异常相关的疾病。此外，它还有消炎、阵痛、抑菌、降血脂等功效。目前，市场上获取熊胆粉的方法主要是引流取胆法，其取材方式在国际上备受争议。因此，寻找开发新的途径，以满足临床对熊胆汁酸类药物的需求具有重要意义。　　熊胆粉的主要特征性药效成分是牛磺熊去氧胆酸(Tauroursodeoxycholic acid，TUDCA)和以一定比例存在的牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)，二者的比例通常在1.0～1.5之间。天然TUDCA仅存在于人和熊体内，而TCDCA广泛存在于家禽的胆汁酸中，二者的区别在于7位羟基的构型不同。据报道，7α-羟基类固醇脱氢酶(7α-hydroxysteroid dehydrogenase，7α-HSDH)和7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-hydroxysteroid dehydrogenase，7β-HSDH)均具有双向氧化还原活性，可以通过两步反应实现7位羟基的差向异构化。基于此，本文拟通过构建带有7α-HSDH和7β-HSDH工程菌，将以TCDCA为主要成分的鸡胆粉进行定向生物转化，以期获得与天然熊胆粉成分组成类似的体外培养产物，从而为中药熊胆粉的可持续利用提供新的研究策略。　　本文主要研究内容如下:　　1.根据文献报道，从GenBank中选择了两个7α-HSDH基因和两个7β-HSDH基因，对密码子进行优化后委托Life Technology公司进行合成，命名为α1，α2，β1和β2。　　2.工程菌构建。首先构建了带有一个α基因和一个β基因的双基因表达载体pα1β1，pα1β2，pα2β1，pα2β2;在此基础上构建了带有一个α基因和两个β基因的多基因表达载体pα1β1β1，pα1β1β2，pα1β2β2，pα2β1β1，pα2β1β2，pα2β2β2，分别导入到E.coli BL21 starTM(DE3)，并对所有工程菌株在30℃条件下发酵，结果显示BL-pα1β2，BL-pα2β2，BL-pα1β2β2，BL-pα2β2β2，BL-pα2β1β2具有较高的转化效率。　　3.考察培养基pH值对发酵影响。分别用HCl和NaOH调节M9培养基pH值，30℃条件下发酵，结果显示培养基pH值在6.5时转化效果最佳，其中BL-pα1β2、 BL-pα1β2β2和BL-pα2β2转化效率最高。　　4.考察蛋白共定位对发酵影响。在pα1β2、pα1β2β2和pα2β2载体基础上构建了27个带有不同组合蛋白共定位结构（scaffold）的表达载体并转入E.coliBL21 starTM(DE3)，得到27个携带有scaffold蛋白结构的工程菌。以pH6.5的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）配制M9培养基，25℃条件下对BL-pα1β2-scaffolds发酵，结果表明，BL-pα1β2转化效率最高，达46.8％;scaffold蛋白结构没有促进转化。　　5.BL-pα1β2与BL-pα1β2β2的发酵比较。25℃条件下，对BL-pα1β2和BL-pα1β2β2发酵12h、24h、36h的转化进行比较，结果表明，二者都于发酵12h时达到最佳的转化效果，其中BL-pα1β2的转化效率是BL-pα1β2β2的1.1倍。因此，选定BL-pα1β2做后续的研究。　　6.考察温度对发酵影响。加入底物之后，分别将温度设定为25℃和30℃，根据测定的产物含量和比例组成，得出底物转化的最佳温度为25℃;加入底物6h后，转化率即可达到44.2±3.5％，是30℃条件下的1.6倍。　　7.考察时间对转化发酵影响。分别于1h、2h、3h、4h、5h、6h、12h、18h收集发酵液，结果表明，发酵时间为6～12h转化率最高，转化率在45.0％左右，且发酵液中TUDCA与TCDCA的比例稳定在1.2左右，与天然熊胆粉中TUDCA与TCDCA的比例相同。　　8.考察PBS调节的M9培养基对转化水平的影响。分别用PBS和HCl控制M9培养基的pH值，两种情况下的转化率分别为47.3±0.7％、28.1±0.4％，结果表明，用PBS调配的M9培养基转化效果为佳。　　9.考察溶氧量对发酵的影响。以不同的发酵体系来模拟不同的溶氧水平，随着溶氧量增加，TUDCA的转化率从37.8±3.0％增加到了47.4±4.7％，继续增加溶氧量，转化效率开始降低。结果表明，溶氧对工程菌转化TUDCA有一定影响，其中容器和装液量的比例在10～20之间时，更利于该转化。　　10.考察底物浓度对发酵的影响。分别用含TCDCA3.1 g/L和4.3 g/L的底物培养基进行发酵，结果表明，提高底物浓度，不会抑制工程菌的转化效率，但产物中TUDCA与TCDCA的比值略有降低，为1.0。　　11.考察底物纯度对转化水平的影响。用TCDCA含量为30％的粗制鸡胆粉作为底物，培养基中TCDCA浓度分别配成1.0 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L。结果显示，不同底物浓度的发酵体系，都在6h后达到了最佳，转化效率在45.0％左右，TUDCA与TCDCA的比例在1.0左右，表明低纯度的底物不影响工程菌的转化效率，但产物中TUDCA与TCDCA的比例略有降低。　　12.考察菌种的最佳种龄。分别用预培养11h、12h、13h的工程菌发酵，以TCDCA含量为50％或30％的鸡胆粉为发酵底物，结果表明，当以TCDCA含量为50％的鸡胆粉为底物时，不同预培养时间的转化结果无差异，而以30％的鸡胆粉为底物时，延长预培养时间有利于转化。　　13.考察不同发酵培养基对转化的影响。在已证实的最适发酵条件的基础上，以LB作为发酵培养基，发酵6h之后的转化率可以达到50.0％，但是所生成的中间产物也较多，表明LB培养基不利于该转化。　　14.放大发酵体系。在最适发酵条件的基础上，以TCDCA含量为50％的鸡胆粉为底物，采用100 mL的锥形瓶，装液量为10 mL，发酵12h的转化效率为51.3±0.6％，TUDCA与TCDCA的比例为1.1，表明在试管中建立的发酵条件也适用于摇瓶培养。