L-谷氨酰胺（L-glutamine,L-Gln）是一种条件必需氨基酸,因其具有免疫和营养双重生理功能,被广泛应用于医药、食品保健品、饲料等行业。本研究以实验室保藏的一株L-Gln产量为25.7±2.7 g·L-1的谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum N01为出发菌株,进行一系列理性代谢改造及发酵工艺优化,以提高L-Gln的产量。主要研究结果如下:（1）增强L-Gln合成代谢流。首先对出发菌N01发酵液进行氨基酸谱测定,发现主要的副产物为L-谷氨酸和L-脯氨酸。敲除L-脯氨酸合成关键酶γ-谷氨酸激酶基因pro B,阻断L-脯氨酸合成途径,构建菌株CGQ01,L-Gln产量为27.2±2.5 g·L-1。敲除CGQ01中编码谷氨酸机械通道蛋白基因NCgl1221,构建菌株CGQ02,L-谷氨酸胞内含量提高、胞外分泌降低了40.3%至9.2 g·L-1,L-Gln产量提高至31.3±2.4 g·L-1。（2）增强关键酶谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase,GS）催化活性。敲除CGQ02中GS腺苷酰化转移酶基因gln E,解除GS腺苷酰化作用,CGQ03菌株的GS酶活性较CGQ02提高了128.6%,L-Gln产量提高至36.2±2.5 g·L-1。接着,从8种不同物种来源GS中筛选获得了一个具有高催化活性的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae来源的Sc GS进行过表达,重组菌GS酶活性提高了8.3倍,L-Gln产量提高了26.8%至45.9±1.4 g·L-1,说明增强GS催化活性是实现L-Gln增产的有效策略。（3）增强胞内ATP供应。在CGQ03中过表达大肠杆菌来源多聚磷酸盐激酶基因ppk,构建ATP再生系统,重组菌CGQ03/p XMJ19-ppk Ec胞内ATP含量较CGQ03提高了22.6%,L-Gln的产量提高了13.8%至41.2±2.7 g·L-1。进一步地,将筛选获得的Sc GS酶基因gln ASc和ppk Ec在CGQ03中串联表达,重组菌CGQ03/p XMJ19-gln ASc-ppk Ec可生产49.5±3.9 g·L-1L-Gln。通过RBS（Ribosome binding site,RBS）工程筛选获得了较强的RBS5进一步提高基因表达水平,重组菌CGQ03/p XMJ19-R5-gln ASc-ppk EcL-Gln产量达52.8±4.1 g·L-1。（4）两阶段p H调控策略优化。根据Cg GS酶学性质,探究不同p H对L-Gln发酵的影响,确定产酸期最佳p H为6.2,解决了菌体生长和发酵产酸之间的不平衡,优化了两阶段p H调控策略。工程菌CGQ03/p XMJ19-R5-gln ASc-ppk Ec在5 L发酵罐上利用优化后的两阶段p H调控策略,发酵66 h L-Gln产量为73.5±3.1 g·L-1,糖酸转化率为36.8%。（5）溶氧控制对L-Gln发酵的影响。比较了不控溶氧（恒定转速和通气量）和控制溶氧水平在30%-40%（转速偶联溶氧及手动提高通气量）两种方式对L-Gln发酵的影响。实验结果显示控制溶氧水平更有利于菌体生长和L-Gln的发酵。最终的工程菌CGQ03/p XMJ19-R5-gln ASc-ppk Ec在5 L发酵罐补料分批发酵66 h,L-Gln的产量最高为89.2±1.7 g·L-1,糖酸转化率为33.5%,生产强度为1.35 g·L-1·h-1。