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中风是全球死亡和长期致残的主要原因,其中缺血性中风(IS)占据中风的80%以上。过往对IS的体外研究,通常采用神经系统内单一类型的细胞,随着研究理念和技术的不断进步,需要进一步强调细胞和细胞之间的关系。自2001年针对IS提出神经血管单元(NVU)的概念后,更加强调神经系统中各类细胞以及其他组分之间的相互作用、相互影响以及动态变化。因而多种模拟脑组织的体外NVU被构建,并对正常和病理状态下的NVU进行了深入的研究,为寻找临床治疗的新靶点提供新思路。清开灵注射液(QKL)作为中药注射液的杰出代表,在治疗IS方面疗效确切。因其成分复杂,物质基础不明,加大了治疗机制研究的难度。本课题组基于QKL开发了成分明确的精制清开灵注射液(RQKL),由栀子苷(GEN)、黄芩苷(BCL)、胆酸(CA)和猪去氧胆酸(HDCA)组成。然而RQKL及其组分对体外NVU的保护作用和机制未进行探讨,因而本课题展开相关研究,以期为IS的治疗提供新的思路。目的本研究的目的为获得高纯度的原代神经元、星形胶质细胞和脑微血管内皮细胞(BMECs),并利用此3类细胞构成体外NVU,以及由星形胶质细胞和BMECs构成体外血脑屏障(BBB),确立体外NVU和体外BBB经氧糖剥夺-复氧复糖(OGD/R)损伤的时间以模拟体内IS。然后观察QKL、RQKL、CA和HDCA对OGD/R后体外NVU的保护作用,以及GEN对OGD/R后体外BBB的保护作用。最后确定RQKL的主要成分BCL可通过BDNF/TrkB/PI3K/Akt和BDNF/TrkB/MAPK/ERK信号通路改善OGD/R后神经元和星形胶质细胞共培养系统的损伤作用。方法体外分离、纯化和培养来自SD大鼠的神经元、星形胶质细胞和BMECs,并利用上述3类细胞的特异性标志物(MAP2、GFAP和vWf)通过免疫荧光染色法鉴定细胞的类型和纯度。然后利用显微镜观察纯化后的3类细胞在240h内的生长状态,并利用CCK8方法检测不同浓度的星形胶质细胞和BMECs在240h内的细胞活力。本实验借助Transwell平台构建体外NVU,于0h,将神经元种植于培养板的孔底;44h,将星形胶质细胞接种于内插小室膜外侧;52h,将BMECs接种于内插小室的膜内侧,共培养120h后(至172h),检测体外NVU的功能,包括BBB的屏障功能和神经元的状态,以确定体外NVU建立成功。BBB的屏障功能包括:紧密连接蛋白ZO-1(免疫荧光染色方法)的表达,ZO-1、occludin和Claudin-5紧密连接蛋白(WB方法)的表达,跨内皮电阻(TEER)值,表观渗透系数(Papp)以及γ-谷胺谷氨酰转肽酶(γ-GT);神经元状态包括:显微镜下状态和微管关联蛋白2(MAP2)的表达。将构建成功的体外NVU于196h时更换无糖earles平衡盐溶液(EBSS),并将其置入装有氧气指示剂和Anaero Pack的培养袋內密封后放入细胞培养箱内培养1h。197h,更换正常培养基于正常条件下培养24h,该处理过程为模拟体内缺血再灌注的体外OGD/R损伤模型。221h,检测体外NVU的功能以确定损伤模型建立成功。此外,本实验借助Transwell平台构建体外BBB,于0h,将星形胶质细胞接种于内插小室的膜外侧,24h,将BMECs接种于内插小室的膜内侧,共培养120h后(至144h),检测体外BBB屏障功能。将体外BBB于168h进行OGD/R处理并检测其屏障功能。利用不同浓度的QKL、RQKL,CA,HDCA,GEN和BCL,分别干预正常培养的神经元、星形胶质细胞和BMECs 6h、12h、24h和48h后,利用CCK8方法检测细胞活力以确定药物对细胞的毒性作用。选择无毒性的药物干预经OGD/R处理的单独培养的3类细胞,通过对单独培养的3类细胞不同时间的氧糖剥夺和再灌注处理后,利用CCK8方法检测细胞活力以确定药物的保护作用。将建立的体外NVU随机分为4组:Control组,Model组,RQKL-H组(15.63μL/mL)和RQKL-L组(0.98μL/mL)。将体外NVU培养至172h时,利用RQKL(15.63μL/mL和0.98μL/mL)干预24h,然后进行OGD/R处理,同时利用上述浓度的RQKL干预,并分为RQKL-H组和RQKL-L组;将经过OGD/R处理的体外NVU作为Model组;将不作任何处理的体外NVU作为Control组。然后检测体外NVU的功能,整个NVU体系的炎症因子(IL-1β,IL-6和TNF-α),氧化应激指标(NO,MDA和SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)、凋亡蛋白(Bcl-2,BAX,caspase3和caspase9)和神经营养因子(GDNF和BDNF)的表达情况。与RQKL处理方法相同,分别检测QKL(7.81μL/mL和0.98μL/mL),CA(93.75μg/mL和11.72μg/mL)和HDCA(10.16μg/mL和2.54μg/mL)对经OGD/R处理的体外NVU的保护作用。将建立的体外BBB随机分为4组:Control组,Model组,GEN-H组(25μg/mL)和GEN-L组(6.25μg/mL)。将BBB模型培养至144h时,利用GEN(25μg/mL和6.25μg/mL)干预24h,然后进行OGD/R处理同时利用GEN干预,并将GEN干预的体外BBB作为GEN-H组和GEN-L组,Model组和Control组处理同RQKL,然后检测体外BBB的屏障功能,BMECs的凋亡情况,以及整个BBB体系的炎症因子,氧化应激指标,神经生长营养因子和LDH的表达情况。0h,将神经元种植于培养板孔底,48h后将星形胶质细胞接种于内插小室的膜内侧,建立神经元和星形胶质细胞共培养体系(NA)并将其共培养124h,将NA随机分为5组:Control组,Model组,BCL-H组,BCL-L组和BCL-ANA组。将NA培养至172h时,利用BCL(34.38μg/mL和8.59μg/mL)和ANA12干预24h,然后进行OGD/R处理50min,且OGD/R过程中仍需用BCL和ANA12干预,并将BCL干预的NA作为BCL高剂量组(BCL-H组,34.38μg/mL)和BCL低剂量组(BCL-L组,8.59μg/mL),Model组和Control组同RQKL,将与BCL高剂量组处理过程相同,同时加入ANA12的NA模型为ANA-BCL组。检测各个组别的神经元的状态,炎症和氧化应激指标的表达情况,进一步检测了TrkB,PI3K,Akt,CREB,ERK1\2和MAPK蛋白的表达情况,探讨BCL发挥保护作用的机制。结果研究获得纯度较高的3类细胞,神经元纯度达93%以上,星形胶质细胞纯度高达99%以上,BMECs纯度高达100%,掌握3类细胞的生长特性。成功构建由星形胶质细胞、BMECs和神经元细胞组成的体外NVU,且由3种细胞构建的体外NVU中BBB的屏障功能更完善,神经元状态更成熟。通过对单独培养的3类细胞不同时间的氧糖剥夺和再灌注处理后,初步确定OGD 1h/R 24h为模拟体内IS的最佳时间。成功构建由星形胶质细胞和BMECs组成的体外BBB,由2类细胞构建的体外NVU中BBB的屏障功能更完善。确定OGD 1h/R 24h为模拟体内IS后BBB损伤的最佳时间。得到目标药物对3类细胞的毒性。获得目标药物的有效保护浓度,并选择2个保护作用具有显著性差异的浓度。所选择的2个浓度的QKL、RQKL、CA和HDCA可增高TEER值、紧密连接蛋白的表达和γ-GT活性,降低Papp的作用来维持OGD/R后NVU中BBB的完整性,以及维持神经元的状态和MAP2的表达。此外,还具有对抗整体体系的炎症、氧化应激和凋亡,以及促进神经营养因子表达的作用。利用具有保护作用的GEN进行体外BBB保护作用的研究,发现GEN可增高TEER值、紧密连接蛋白表达和γ-GT活性,降低Papp的作用来维持OGD/R后BBB的完整性,同样可对抗整体体系炎症、氧化应激和凋亡,以及促进神经营养因子表达的作用。进一步研究发现BCL可促进BDNF的表达,加入BNDF的特异性抑制剂后,BCL对抗炎症,氧化应激和凋亡的能力减弱。此外,发现BCL可明显的促进BDNF的结合受体TrkB的表达,下游MAPK/ERK信号通路上P38和ERK1/2的表达,以及PI3K/Akt信号通路上PI3K和Akt的表达,此外还可促进CREB的表达。结论QKL、RQKL及RQKL组分具有对抗炎症、氧化应激和凋亡,以及促进神经营养因子表达的作用,还具有同时保护体外NVU中BBB和神经元的作用。BCL可通过调节BDNF/TrkB/PI3K/Akt和BDNF/TrkB/MAPK/ERK信号通路发挥神经保护作用。