滇水金凤CHI与F3’H基因的克隆及表达分析

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滇水金凤是凤仙花科凤仙花属一年生草本植物,主要分布在我国西南及华南地区,花型奇特,颜色绚丽,耐受性强,在园林上有一定的应用价值。花色作为观赏植物较为重要的性状,一直是园林园艺工作者最重要的育种目标之一,同时也是目前的研究热点之一。滇水金凤有白色、红色、粉色和深红色。本文主要针对滇水金凤花青素合成途径中的IuCHI与IuF3’H基因进行研究,采用RT-PCR和RACE-PCR技术分离克隆其cDNA全长,并采用qRT-PCR技术进行实时荧光定量表达,重点分析CHI与F3’H基因的序列特征及其在滇水金凤花色形成过程中的作用。通过实验获得成果如下:(1)以滇水金凤花瓣为材料,提取RNA采用RT-PCR逆转录成cDNA,通过3’-RACE、5’-RACE技术和DNA全基因组扩增获得两个滇水金凤IuCHI基因全长cDNA和内含子,分别命名为IuCHI1和IuCHI2,得到以下结果:IuCHI1基因的cDNA序列全长940bp,外显子741bp,包含三个内含子;IuCHI2基因的cDNA序列全长949bp,外显子747bp,包含三个内含子。通过构建系统发育树发现,IuCHI的两个拷贝聚为一支,分析其亲缘关系较近,在进化过程中比较保守。IuCHI1与IuCHI2的基因结构类似,均具有两个外显子和三个内含子,这与其亲缘关系近进化过程保守相符合。(2)以滇水金凤花瓣为材料,提取RNA采用RT-PCR逆转录成cDNA,通过3’-RACE、5’-RACE技术和DNA全基因组扩增获得三个滇水金凤IuF3’H基因全长cDNA和内含子,分别命名为IuF3’H1、IuF3’H2和IuF3’H3,得到以下结果:IuF3’H1基因的cDNA序列全长1683bp,外显子1560bp,包含两个内含子;IuF3’H2基因的cDNA序列全长1683bp,外显子1560bp,包含两个内含子;IuF3’H3基因的cDNA序列全长1586bp,外显子1560bp,包含两个内含子。通过构建系统发育树发现,IuF3’H2和IuF3’H3聚为一支,而IuF3’H1在另一分支里,推测IuF3’H1可能是IuF3’H2和IuF3’H3的旁系同源。(3)采用qRT-PCR技术对IuCHI基因与IuF3’H基因在红色和白色滇水金凤花的四个发育时期的荧光定量表达分析,可以发现,CHI基因在有色花红色滇水金凤的四个发育时期(花苞期、花苞开放期、盛花期、谢花期)的表达量呈现逐渐上升的趋势,推测CHI基因的表达量可能与红色花色苷的积累有着某种内在的关联;而在无色花白色滇水金凤的四个发育时期,CHI基因在第三时期的表达量最多,其它几个时期的表达量相对较少,推测可能与黄酮类物质的积累有关。F3’H基因在有色花红色滇水金凤每个时期的表达量都比在无色花白色滇水金凤中的表达量要高,推测F3’H的表达量与滇水金凤花色形成的色素积累有一定的关系。
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