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胶原蛋白三螺旋区域含有丰富的ACE抑制活性肽段,然而胶原三螺旋区异常稳定,不易被金属基质蛋白酶以外的蛋白酶降解,为暴露出更多酶切位点,促进ACE抑制肽段在普通蛋白酶作用下快速释放,在胶原蛋白水解前通常需进行预处理。目前尚无专门针对预处理促进胶原ACE抑制肽快速释放的研究报道。本研究旨在探究出一种简单易行且可高效制备胶原ACE抑制肽的预处理方式,并对其作用机制进行深入研究。试验研究了酸、碱、热、超声、超高压5种预处理方式单独作用与超声和酸碱协同作用对胶原ACE抑制肽释放的影响,并对水解液中ACE抑制肽进行分离纯化与序列鉴定。以无处理组为对照,采用酸、碱、热、超声、超高压预处理胶原蛋白,随后进行酶解,对不同时间点水解液的水解度、ACE抑制率和分子量分布及预处理后胶原蛋白的热稳定性和结构进行研究分析。结果发现,5种预处理方式对胶原蛋白的水解均有促进作用,而对ACE抑制率的影响因处理方式而异,其中超声处理、碱处理组水解液ACE抑制活性高且ACE抑制肽段释放速率快。结合酶解液多肽分子量分布及预处理后猪皮胶原的DSC、FIRT结果得出,碱处理破坏了胶原的非共价键平衡,改变了胶原构象特点,其螺旋区域的酶切位点被充分暴露,经蛋白酶解后可得到更多源于螺旋区域的ACE抑制肽；超声处理破坏了胶原中部分共价交联,使多肽链伸展或内部疏水性基团外露,暴露出更多疏水性位点,有利于碱性蛋白酶的酶解；其他处理方式破坏的可能大多是胶原非螺旋区,对胶原三螺旋区域酶切位点的暴露促进程度有限。基于前期的研究,将超声与酸碱处理相结合对胶原进行预处理,结果显示超声协同酸碱预处理较前期各预处理方式更有利于胶原ACE抑制肽的快速释放,酶解1min时二者ACE抑制率均达88%以上,高于前期各处理方式酶解4h的水平,比较发现,超声协同碱较超声协同酸处理组ACE抑制肽释放速率更快。结合分子量分布及DSC、红外光谱结果分析发现,超声协同酸处理更多破坏了胶原分子间的共价交联,而超声协同碱主要破坏了维系三螺旋构象的氢键进而改变胶原亚基分子的构象,对共价键影响不大,且后者对三螺旋区酶切位点的暴露较前者更为明显。扫描电镜结果显示,碱液可破坏胶原蛋白,但破坏仅限于胶原蛋白表面,在超声协同碱的作用下,胶原蛋白形成了小颗粒,这可能增大了胶原的比表面积,使之暴露出更多酶切位点,有利于酶解进行。采用SephadexG-15、半制备高效液相色谱对超声协同碱处理酶解30min的样品进行分离纯化,纯化后的样品进行序列鉴定。其中SephadexG-15分离胶原ACE抑制肽的最佳分离条件为：样品浓度100mg/mL；上样量2mL；流速2mL/min;洗脱剂为蒸馏水：层析柱为1m×10mm的层析柱。在该分离条件下,混合肽被分成AP-Ⅰ、AP-Ⅱ两个组分,IC50值分别为19.501、1.005mg/mL。对抑制活性较强的AP-Ⅱ进一步采用半制备高效液相色谱进行分离,其最佳分离条件为柱温30-C,进样43.51.μ(浓度10mg/mL),流速4.35mL/min,采用10%乙腈(含0.05%TFA)等度洗脱40min。半制备后得到8个组分峰,其中峰5和峰6的IC50值最大,峰2次之,结合ICso值的大小及半制备收集到样品的量,对峰2和峰6采用LC-MS/MS进行序列分析。结果显示峰2的多肽序列为QGPPGPAGPR,峰6的序列为AGPPGPPGPA,这两个序列分别源于胶原蛋白α1链中526～535、730～739的位置,二者的氨基酸组成符合ACE抑制肽的构效特点,且目前尚无文献报道。