急性缺血性脑血管病是严重危害人们身体健康的中枢神经系统疾病，而神经元的缺血再灌注损伤是急性缺血性脑血管病最主要的病理生理过程，其严重程度直接影响到脑组织结构和功能的损伤程度以及患者预后的好坏。Ca²⁺超载在缺血性脑损伤中的作用一直是人们研究的热点，被称为神经元死亡的最后共同通路。而核转录因子（nuclear factor κB，NF-κB）是一种重要的转录因子，参与真核细胞多种基因的表达调控，影响着细胞的生长、分化、免疫和炎症、凋亡、癌变和个体发育等多种生物学功能，在脑缺血再灌注损伤中对炎症过程的产生发挥着关键性的作用。我们最近的研究发现，在中枢神经系统缺血损伤中，Ca²⁺可能参与了，NF-κB的激活与调控。因此，本实验希望通过对大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（PC12）这一研究中枢神经系统疾病常用的模型细胞在类缺血再灌注损伤时Ca²⁺水平和NF-kB表达变化的观测，探讨Ca²⁺介导类缺血再灌注损伤PC12细胞NF-κB激活的可能机制。 本实验分为两部分：第一部分包含实验一和实验二，主要内容是PC12细胞类缺血再灌注损伤模型的建立，以及细胞内Ca²⁺浓度和NF-κB表达变化的检测。将常规传代培养的PC12细胞放入自制的类缺血装置中进行类缺血处理，运用流式细胞仪检测不同时间点凋亡细胞的比例，并在倒置显微镜下观察细胞形态，取凋亡细胞比例开始显著增大的时间作为后续实验中类缺血处理的标准时间；按照标准时间将PC12细胞进行类缺血处理，然后进行不同时间的再灌注处理，运用激光共聚焦显微镜观测各时间点的胞内Ca²⁺浓度，并用免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测各时间点NF-κB的表达。第二部分包含实验三和实验四，运用细胞膜Ca²⁺通道阻断剂氟桂利嗪和Ca²⁺／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ 第四军医大学硕士学位论文 （eaZ+/c日modulin一d即endent protein hnase 11，eaZ+/C咖PK Ix）竞争性抑制剂KN一93分别进行干预，检测c扩十浓度和NF一虑表达的变化情况，并对细胞活性进行检测。将培养的PC12细胞随机分为氟桂利啧组、单纯类缺血再灌注组和阴性对照组，将氟桂利嗦组施加氟桂利嗦预处理后和单纯类缺血再灌注组一起进行类缺血再灌注处理，运用激光共聚焦显微镜观测三组细胞的胞内c扩+浓度，用免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测各时间点NF一妞的表达，用甲基唆哇蓝（methyl thiazolyttetraZoliuln，MTT）比色法对三组的细胞活性进行检测;同样的将PC12细胞随机分为KN一93组、单纯类缺血再灌注组和阴性对照组，将KN一93组施加KN一93预处理后和单纯类缺血再灌注组一起进行类缺血再灌注处理，用免疫细胞化学染色和流式细胞仪检测各时间点NF一虑的表达，用MTT比色法对三组的细胞活性进行检测。 本实验结果如下: （l）类缺血处理3Omin后PC12细胞开始出现明显的细胞凋亡， 之后凋亡细胞比例逐渐下降，坏死细胞比例逐渐增高;PC12 细胞遭遇类缺血损伤后胞体缩小，突起变短、断裂，贴壁能 力降低。 （2）类缺血处理30min再灌注处理0、15、30min后的PC12细胞 胞内C扩+浓度比不作任何处理的阴性对照组明显升高，再灌 注30min时为最高，再灌注15、3Omin比再灌注omin也有明 显的升高;流式细胞仪检测显示阴性对照组只有很低水平 NF一出的表达，而经类缺血再灌注处理的细胞NF一虑表达明 显高于阴性对照组，再灌注巧min时表达己经升高，表达高 峰为再灌注30min，此后再灌注60、120min时NF一妞的表达 又下降，经免疫细胞化学染色可见胞体变小，着色加深，Omin 组主要在细胞质中着色，15、30、60min组细胞质、细胞核 都有着色，而12Omin组为细胞核着色。 （3）经类缺血再灌注处理后氟桂利嗦组胞内c扩+浓度比单纯类缺 血再灌注组明显降低;流式细胞仪检测显示氟桂利嗦组 NF一妞的表达水平于再灌注15、30min都明显低于单纯类缺 血再灌注组，免疫细胞化学染色可见氟桂利啧组比单纯类缺第四军医大学硕士学位论文 血再灌注组着色浅，而且氟桂利嚓组的着色部位在细胞质中， 而单纯类缺血再灌注组在细胞质、细胞核中都有;M竹比色 检测细胞活性显示氟桂利嗦组的细胞活性明显高于单纯类缺 血再灌注组。（4）流式细胞仪检测显示经类缺血再灌注处理后KN一93组NF一虑 的表达水平于再灌注15、3Omin都明显低于单纯类缺血再灌 注组，免疫细胞化学染色可见KN一93组比单纯类缺血再灌注 组着色浅，而且KN一93组的着色部位在细胞质中，而单纯类 缺血再灌注组在细胞质、细胞核中都有;MTT比色检测细胞 活性显示KN一93组的细胞活性明显高于单纯类缺血再灌注 组。本次实验结论如下:（1）PC12细胞可以作为研究中枢神经系统急性类缺血再灌注损 伤的模型细胞;（2）急性类缺血能引起PclZ细胞胞内c扩+浓度的上调，而类缺 血后的再灌注会进一步加重?