低温、干旱和高盐等是影响植物生长发育和产量的最重要的非生物胁迫。许多重要的作物,比如水稻、玉米、大豆、棉花和番茄等,对冷都比较敏感,而且冷适应能力差。东北地区是我国玉米的主产区,也是种植面积最大的作物,但是由于地理条件原因,在春季经常遭受低温冷害的侵袭,造成大面积减产,尤其在严重低温冷害年东北玉米减产可达20%以上,产量年际间波动较大,对玉米稳产造成了很大的威胁,而且玉米品质也随之下降,冷胁迫已经成为限制东北地区玉米产量的主要非生物胁迫之一。随着对玉米需求量的加大,以及国外品种的进入,如何选育出强优势玉米杂交种,提高玉米产量成为当务之急。因此,对玉米冷响应机理的研究十分重要。本研究利用低温发芽,苗期低温筛选,冷胁迫相关生理生化指标测定,并结合田间验证,对296个自交系进行抗冷性筛选,成功的筛选出抗冷玉米自交系3个,并提出了一套有效的筛选玉米抗冷种质资源方法,开发出3对EST分子标记。采用cDNA-AFLP技术,利用336对引物组合,对玉米冷胁迫不同处理时间的基因表达差异进行了分析。结果发现了大约10,000条片段,其中441条片段是差异表达的,约占4%左右。平均每个引物组合大约30-50条带,大小从70到600 bp。根据这441条差异表达TDF的表达情况,可以把差异表达的TDF分为:诱导型、晚期诱导型、早期瞬时诱导型、上调型、快速抑制型、逐渐抑制型、下调型和其他表达类型,最后成功回收测序了114条差异片段。通过序列分析发现,有58条TDF与已知功能的基因有较高的同源性,这些基因分别参与了代谢(13, 11.40%)、光合作用和能量(10, 8.77%)、转运(5, 4.39%)、信号转导(11, 9.65%)、次生代谢(2, 1.75%)、防御响应(7, 6.14%)、转录(3, 2.63%)、细胞骨架(3, 2.63%)和转座子元件(4, 3.51%),表明冷胁迫下各种不同功能基因表达以适应不利的环境。通过半定量RT-PCR,验证了7个与玉米抗冷相关的未知候选基因。并利用电子克隆方法成功克隆出三个新的抗冷相关基因的cDNA全长,分别命名为ZmMAPKKK (1266 bp),ZmCLC-D (1302 bp)和ZmRLK (1447 bp),Genbank接收号分别为GU344734, GU344733和GU344735。生物信息学分析表明,ZmMAPKKK,ZmCLC-D和ZmRLK与其他植物具有高度的同源性,具有典型的该家族基因保守区。进化树分析表明,这些基因与水稻中的该族基因的亲缘关系最近。Real time qRT-PCR结果表明,冷胁迫强烈诱导这三个基因的表达,并且随着冷处理时间的延长,表达量显著提高,尤其是在冷处理12小时。在基因表达的最高峰时,表达量增加了3-4倍。成功的构建了植物高效表达载体pCAMBIA3301-ZmMAPKKK, pCAMBIA3301-ZmCLC-D, pCAMBIA3301-ZmRLK,并利用农杆菌介导法对拟南芥和玉米进行了遗传转化。本研究还利用MSAP技术对玉米幼苗在冷胁迫不同时间的甲基化变异情况进行了分析。分析结果表明在6个时间点,玉米的总体甲基化相对水平在30.76%～31.53%之间。虽然不同冷处理时间的总体甲基化水平相差不多,但所有处理后的非甲基化位点的比例都略少于未处理的对照。据此结果,结合已知的甲基化与基因表达的关系,我们推测冷胁迫后非甲基化CCGG位点的增加可能有助于许多基因的表达水平上调,进而可能与玉米冷响应机制有关。此外,通过对冷胁迫处理后相对于对照4种类型的带处理组表现出不同的变异情况。A1、B1、C1为处理后没有变化的带,在处理组其总和占本类扩增条带的主流(约占总位点的90%左右)。这说明在冷胁迫过程中DNA的大多数位点是可以维持其正常甲基化状态的。但在冷处理2小时、6小时和12小时过程中,发生甲基化变异的位点所占比例大约在12%左右,但在冷处理24小时后,发生甲基化变异的位点只有6%左右。在冷处理48小时后,发生甲基化变异的比例有所提高,达到了10%左右。回收测序了211差异片段,序列分析发现只有28个序列可能找到其同源基因。这些基因与植物生长发育过程中的多个过程有关。此外,我们还发现3个序列与转座子和反转座子同源。冷胁迫可以诱导玉米转座子的激活,从而发生甲基化变异以适应环境胁迫。本文成功的构建4个小RNA文库(正常温度、冷处理2小时、6小时和12小时),采用solexa高通量测序技术测序了这4个小RNA库,分析在冷胁迫下miRNA对玉米冷适应的调节。4个小RNA库共测序片段48495408条,数量最多是21 nt和24 nt的小RNA,分别占28.23%和35.55%。通过直接克隆的方法确定了候选miRNA的种数为2360种,数量为21853812条。对各库之间已知的miRNA的差异表达进行分析,56个已知miRNA表达量差异达到显著或极显著水平,其中38个miRNA是下调表达的,占67.86%;18个miRNA是上调表达的,占32.14%。聚类分析将表达模式相近的miRNA聚在一起。所有差异表达的82条miRNA通过4次聚类最终聚到一个大类中。在倒数第二次聚类中,可以把差异表达的miRNA聚类成5个亚类。预测了2360个新miRNA和11,309个靶基因位点,这些靶基因涉及到植物的各个方面,包括植物生长发育(纤维素合成酶、叶绿素结合蛋白、早期开花蛋白等),胁迫响应(防卫素、凝集素、热激蛋白等),信号转导(钙调蛋白、丝氨酸/苏氨酸受体蛋白激酶、促分裂源活化蛋白激酶等),代谢(糖转运蛋白,谷氨酰胺合成酶,ATP酶等),转录(翻译起始因子蛋白,转录辅激活蛋白等),营养元素吸收(钾转运体蛋白,镁转运体蛋白、氯离子通道蛋白等),抗氧化剂(过氧化氢酶,抗坏血酸氧化酶等)。这说明玉米在冷胁迫时,miRNA对其靶基因进行调节,体内发生各种生理生化的变化适应不利的环境。本研究大量实验表明,玉米存在复杂的机制来响应低温环境,本文从转录水平、甲基化变异和转录后水平进行研究,拓宽了目前对玉米冷胁迫响应的理解和认识,为冷胁迫的复杂调控网络以及相关的miRNA研究提供了重要信息,对今后利用抗冷基因及miRNA改良玉米抗冷性具有重要的理论价值和应用价值。