【摘 要】
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臭蒿是菊科蒿属植物,臭蒿无水乙醇提取物具有抗真菌活性。本文以臭蒿作为实验材料,烟草链格孢菌和深绿木霉为供试菌种,研究臭蒿抗菌成分的提取方法,对抗菌成分进行分离、纯化
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臭蒿是菊科蒿属植物,臭蒿无水乙醇提取物具有抗真菌活性。本文以臭蒿作为实验材料,烟草链格孢菌和深绿木霉为供试菌种,研究臭蒿抗菌成分的提取方法,对抗菌成分进行分离、纯化和分析,并对其抗真菌活性和抗真菌机理进行初步探索。1.利用超声波辅助恒温磁力搅拌法提取臭蒿抗菌成分,通过抑菌实验结果和提取率的比较,得出提取臭蒿的条件,臭蒿粉粒径≤0.154 mm,提取溶剂为石油醚(II类),料液比1:15(g/mL)。石油醚提取液蒸干经乙醇溶解,过滤得到乙醇溶液,蒸干得臭蒿粗提物。臭蒿粗提物对真菌的毒力测定结果表明,其对烟草链格孢菌菌丝EC50=1.25 mg/mL,对深绿木霉菌丝EC50为2.51 mg/mL,对烟草链格孢子萌发的EC50=5.04 mg/mL,表明臭蒿粗提物具有较好抗真菌活性。2.利用色谱分离法对臭蒿粗提物进行粗分和细分,利用孢子萌发法对抗菌组分进行活性评价,采用高效液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)分析抗菌组分的物质组成。结果显示:臭蒿粗提物粗分得到13种组分(Fr.1Fr.13),其中组分Fr.5抗菌活性最好,对组分Fr.5细分得到4种组分(Fr.5.1Fr.5.4)。Fr.5.2对烟草链格孢菌孢子的EC50为0.57 mg/mL。LC-MS分析出Fr.5.2主要由去氧双羟基蒿甲醚(17.00%)、去氧双氢青蒿素(43.65%)、去氧青蒿素(16.15%)组成。以双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)为标准品,测得Fr.5.2中DHA的含量为40.95%,DHA对烟草链格孢菌孢子的EC50为2.70 mg/mL,表明Fr.5.2中主要抗菌物质为青蒿素衍生物。3.为了研究青蒿素衍生物的抗菌机理,测试Fr.5.2和DHA对烟草链格孢菌的抗菌活性、细胞膜完整度、胞内物质的泄露、菌体和孢子的影响。结果发现:Fr.5.2对烟草链格孢菌MIC(Minimum Inhibitory Concentration,)为1.25 mg/mL,MBC(Minimum Bactericidal Concentration)为2.5 mg/mL,DHA对烟草链格孢菌的MIC为5 mg/mL,MBC为10 mg/mL。0.625 mg/mL Fr.5.2和2.5 mg/mL DHA作用于烟草链格孢菌,在0-3 h,细胞膜完整度不断下降,胞内核酸大分子不断流失;SEM观察发现菌丝体细胞膜细小、有空洞,孢子表面也有凹陷;Fr.5.2和DHA还可以抑制麦角甾醇的合成,与空白组相比,麦角甾醇的含量分别降低29.77%,28.99%,孢子平均密度提高,但是萌发率降低。这些实验结果表明,青蒿素衍生物能够抑制真菌麦角甾醇的合成,破坏细胞膜,阻碍真菌细胞的新陈代谢,破坏真菌孢子,能有效的抑制、杀死真菌。
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