论文部分内容阅读
目的：观察TGF-β1对人乳腺癌细胞中HMGA1表达的影响，探讨PI3K信号通路在TGF-β1对人乳腺癌细胞HMGA1表达调控过程中的作用。方法：以体外培养的乳腺癌细胞(MCF-7,MDA-MB-231)为研究对象，研究TGF-β1对人乳腺癌细胞HMGA1表达的影响及其作用机制，实验分为四部分：第一部分研究TGF-β1对人乳腺癌细胞HMGA1表达的影响。量效研究：实验分组为5组，即对照组（无胎牛血清培养液），0，2，5，10，20（ng/ml）TGF-β1组，细胞经过处理后12小时，应用qRT-PCR和免疫荧光法联合检测HMGA1表达水平。时效研究：实验亦分为5组，即对照组（无胎牛血清培养液），以5ng/ml TGF-β1处理乳腺癌细胞0，3，6，9，12小时后，应用qRT-PCR和免疫荧光法联合检测HMGA1表达。第二部分研究PI3K信号通路在TGF-β1对乳腺癌细胞HMGA1表达调控过程中的作用。实验分为6组：即对照组（无胎牛血清培养液），TGF-β1（10ng/ml）组，TGF-β1（10ng/ml）+LY294002（10μmol/L）组，TGF-β1（10ng/ml）+LY294002（20μmol/L）组，TGF-β1（10ng/ml）+Wortmannin（50nmol/L）组，TGF-β1（10ng/ml）+Wortmannin（100nmol/L）组。先以PI3K抑制剂（LY294002、Wortmannin）处理细胞2小时后，再加入TGF-β1（10ng/ml）处理12小时，然后应用qRT-PCR和免疫荧光法联合检测乳腺癌细胞HMGA1表达水平。第三部分研究不同浓度的TGF-β1对乳腺癌细胞HMGA1启动子活性的影响。实验分为4组：即PGL4.10组（对照组），2，5，10ng/ml TGF-β1组，对细胞进行瞬时转染后检测其活性变化。Sp1在TGF-β对人乳腺癌细胞HMGA1表达调控过程中的作用。实验分为7组：空白对照组，核蛋白复合物组，核蛋白复合物+冷探针竞争组，核蛋白复合物+Sp1抗体组，核蛋白复合物+Sp1抗体+TGF-β1组，核蛋白复合物+p-Sp1抗体组，核蛋白复合物+p-Sp1抗体+TGF-β1组。第四部分研究HMGA1对Snail启动子活性的影响。实验分为4组：即PGL4.10组（对照组），p21641μg组， Snail1μg+p21641μg组，Snail1μg+p21642μg组，Snail1μg+p21643μg组，转染细胞后检测其活性变化。结果：1)TGF-β1对人乳腺癌细胞HMGA1表达的影响。量效研究：qRT-PCR结果：与对照组相比，5ng/ml和10ng/ml TGF-β1组乳腺癌细胞的HMGA1mRNA表达明显增高，在MCF-7细胞中以10ng/ml TGF-β1组升高幅度最为明显（P<0.05），在MDA-MB-231细胞中以5ng/ml TGF-β1组升高幅度最为明显（P<0.05）。免疫荧光结果：在MCF-7细胞中，与对照组相比，用5ng/ml和10ng/ml TGF-β1处理细胞后HMGA1平均荧光强度明显升高。时效研究：与对照组相比，HMGA1mRNA水平从3小时组开始升高，至9小时组时其表达达到峰值，至12小时组时开始下降（p<0.05）。免疫荧光结果：在MDA-MB-231细胞中，与对照组相比，8小时组HMGA1平均荧光强度明显升高。2）PI3K信号通路在TGF-β1对乳腺癌细胞HMGA1表达调控过程中的作用。qRT-PCR和荧光法联合检测显示PI3K抑制剂LY294002及Wortmannin（浓度分别为20μmol/L及100nmol/L）对TGF-β1诱导人乳腺癌细胞HMGA1表达有抑制作用（P<0.05）。3）TGF-β1对人乳腺癌细胞HMGA1启动子活性的影响。量效研究结果：与对照组相比，2，5，10ng/ml TGF-β1能增加HMGA1启动子活性，在MCF-7细胞中，以10ng/ml TGF-β1组升高最明显（P<0.05），在MDA-MB-231细胞中以5ng/ml TGF-β1组升高最明显（P<0.05）。Sp1参与了TGF-β1对人乳腺癌细胞HMGA1表达的调控。4）HMGA1对Snail启动子活性的影响。在MCF-7细胞中增加HMGA1表达质粒的浓度，Snail启动子的活性无明显影响（P>0.05）。在MDA-MB-231细胞中，随着HMGA1表达质粒的增加，Snail启动子活性也随之增加。结论：1）TGF-β1可以诱导人乳腺癌细胞中HMGA1的表达。2）PI3K/AKT信号途径在乳腺癌细胞中可能参与了TGF-β1调控HMGA1表达过程。