研究背景和目的结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是世界常见恶性肿瘤,随着人们生活水平的日益提高及社会的逐步老龄化,我国结直肠癌的发生率以年均4%的增幅不断攀升,目前已发展成为我国第四大常见恶性肿瘤。结直肠癌的发生发展是一个多步骤多基因作用的过程,与多种癌基因激活和抑癌基因失活相关,探讨结直肠癌演进过程中相关基因谱改变情况是揭示结直肠癌发生发展机制的主要方式。T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(T lymphoma invasion and metastasis, Tiam1)基因是从BW5147小鼠的T淋巴瘤细胞高侵袭变异株中分离克隆出来的。人Tiam1基因位于第21号染色体的q22.1,含5521个碱基,其编码产物由1591个氨基酸残基组成,属于Dbl家族成员(diffuse B-cell lymphoma oncogene family)。是目前最受重视的鸟嘌呤核苷酸转换因子(guanine nucleotide exchange factor, GEFs)之一。GEFs主要功能是调节Rho家族活性。Rho家族包括Rho, Rac和Cdc42,是Ras超家族的成员,参与细胞骨架形成,在调节细胞骨架结构重组、细胞周期进程、基因表达调控、细胞迁移和粘附等细胞生命活动中起重要作用。多项研究表明,Tiam1基因在正常鼠脑和睾丸组织中高表达,在其他正常组织中低表达或不表达,通过对来源于人和啮齿类肿瘤源性的40多个细胞系的检测发现,Tiam1在所有的肿瘤细胞系中都表达,但在来源于相同组织类型的不同肿瘤细胞系中其表达强度不同,与肿瘤侵袭转移能力密切相关,特别是在低分化和伴有局部浸润或远处转移的腺癌、鳞癌组织中呈强阳性表达。我们在前期通过自主研发的结直肠癌肿瘤转移相关基因cDNA芯片、结合文献轮廓挖掘微阵列表达数据的生物信息学技术,发现Tiam1基因与结直肠癌转移密切相关。本实验室前期研究结果显示,Tiam1在正常结直肠粘膜上皮细胞中不表达或低表达,在结直肠癌和淋巴结转移癌中表达逐步增高；Tiam1mRNA在具有转移潜能的癌细胞株SW620和LoVo中高表达,在原发癌细胞株SW480、HCT116、HRT-18、LST和Hce8693中度表达,在LS174T表达较低,在HT29细胞中完全不表达。应用RNAi技术沉默SW480细胞中Tiam1基因的表达,发现细胞的增殖和侵袭转移能力显著降低；HT29细胞转染Tiam1cDNA后细胞的成瘤能力和侵袭能力显著增强。这些研究均提示,Tiam1与结直肠癌的发生、发展密切相关,在结直肠癌的演进过程中发挥重要作用,但是体外基因功能研究往往不能完全模拟基因在体内的作用形式和机制。为在活体内接近“真实”地再现Tiam1过表达在结直肠癌发生发展中的作用,本研究在前期已成功构建可视化Tiam1转基因小鼠模型的基础上,应用二甲基肼(DMH)诱导Tiam1转基因小鼠与野生型小鼠结直肠癌发生,动态对比观察肿瘤生长、侵袭及转移情况,活体内整体水平探讨Tiam1过表达对结直肠癌发生发展过程的影响。方法1.筛选结直肠高表达Tiam1的转基因小鼠纯合子首先以5只Tiam1转基因首建鼠(F0)为种鼠,分别与野生型ICR小鼠交配产下子代,待子代小鼠(F1)长至3周龄后,剪取1-1.5cm长鼠尾,提取DNA,利用PCR方法检测F1代小鼠Tiam1基因,筛选出Tiam1阳性F1代小鼠(半合子)。然后将半合子近亲交配产下F2代,再经PCR方法筛选出Tiam1阳性F2代小鼠。最后将Tiam1阳性F2代小鼠与野生型ICR小鼠交配产下F3代,检测F3代小鼠Tiam1基因,全部仔鼠Tiam1表达阳性则其亲本F2为纯合子。通过整体荧光成像系统观察小鼠脏器绿色荧光强度以及免疫组化方法检测小鼠Tiam1蛋白表达情况,筛选结直肠Tiam1高表达而其它脏器Tiam1表达相对较低的雄性和雌性小鼠各一只,繁育建系,用于后期动物实验。2.构建小鼠结直肠肿瘤模型,分析Tiam1过表达对小鼠结直肠癌发生发展的作用随机选取8周龄、体重20-25g的Tiam1转基因小鼠和野生型对照小鼠各50只,雌雄比为1：1,饲以常规饲料,自由饮水。给予小鼠腹腔注射0.4%二甲肼(DMH),20mg/kg,每周一次,连续24周(每次注射前DMH以无菌生理盐水配制,NaHCO3调节pH至6.5-7.0)。首次注射DMH后8、12、16、20、24周末随机处死解剖转基因和野生型对照小鼠各5只,并于32周末处死全部剩余小鼠,取其脑、心、肺、胸腺、肝、脾、肾、胃、肠、腹膜、睾丸、膀胱、子宫,用预冷的PBS溶液冲净,滤纸稍拭后,测量各脏器大小、重量,观察颜色、质地、形态变化并记录结直肠肿瘤大小(游标卡尺测量其半径,根据公式V=4/3πr3计算肿瘤体积)、位置、数目以及其他脏器有无结直肠癌转移；将小鼠脏器标本置于10%福尔马林溶液中固定,石蜡包埋,切片,HE染色,Tiam1和Ki-67免疫组化,观察比较Tiam1转基因小鼠和野生型小鼠结直肠粘膜上皮及结直肠癌细胞增殖、结直肠癌发生率以及肿瘤生长和侵袭转移能力。3、统计学方法用SPSS13.0软件进行数据分析,分别采用Pearson卡方检验和两独立样本t检验,P<0.05认为差异具有统计学意义。结果1.筛选结直肠高表达Tiam1的转基因小鼠纯合子以5只Tiam1转基因首建鼠(F0)为种鼠,繁育出390只F1、256只F2和573只F3代小鼠,通过对仔鼠Tiam1基因的检测证实48号与36号首建鼠Tiam1基因能够稳定传代,筛选出44只Fl、146只F2代Tiam1阳性小鼠,获得13只纯合子；整体荧光检测与Tiam1免疫组织化学结果显示,48A♀和48H♂结直肠荧光强度最强且Tiam1表达强阳性,而其他脏器Tiam1表达相对较低,由此,我们获得了结直肠Tiam1高表达而其它脏器Tiam1表达水平相对较低的雄性和雌性Tiam1转基因小鼠纯合子各一只,将其繁育建系,用于后期动物实验。2、构建结直肠肿瘤模型,分析Tiam1过表达对小鼠结直肠癌发生发展的影响DMH注射8周后,部分小鼠结直肠粘膜上皮局灶性增生改变,淋巴组织反应性增生；12周后,多数小鼠结直肠粘膜皱襞粗大,镜下见粘膜层明显增厚,部分区域腺体呈轻-中度不典型增生,Ki-67免疫组化染色显示,Ki-67阳性细胞主要集中在下1/2的结直肠粘膜上皮细胞,上1/2的结直肠粘膜上皮细胞表达较弱,转基因小鼠阳性细胞数与野生型小鼠无显著差异(t=0.391,P>0.05)；16周后,两组小鼠均有1只发生结直肠腺瘤；20-32周,小鼠结直肠肿瘤发生率逐渐增加,组织类型以腺癌为主,镜下见肿瘤可深达粘膜下层或肌层,腺体密集,呈背靠背或筛网状排列,胞核形态与大小极不规则,核膜增厚,核仁大,核出现粗大的染色质颗粒,核分裂相多见。分别比较20、24、32周两组小鼠结直肠癌发生率,结果显示两组小鼠结直肠癌发生率均无显著差异(χ2=0.612, P>0.05;χ2=0.590, P>0.05;χ2=0.585, P>0.05)。32周观察小鼠结直肠肿瘤大小发现,转基因小鼠肿瘤体积较野生型小鼠肿瘤大,且差异具有统计学意义(t=8.343,P<0.05),免疫组化染色显示转基因小鼠结直肠癌组织中Tiam1表达呈强阳性(++++),野生型小鼠Tiam1表达呈阴性或弱阳性(-/+),转基因小鼠癌组织Ki-67阳性细胞数比野生型小鼠阳性细胞数多,差异具有显著性(t=11.203,P<0.05)。值得注意的是,32周时发现4只转基因小鼠结直肠癌发生肝、腹膜、肺转移,野生型小鼠未见癌转移。以上结果提示Tiam1转基因小鼠体内Tiam1过表达能够增强结直肠癌细胞增殖以及侵袭转移能力,但可能对小鼠结直肠癌的发生无明显影响。结论1、利用5只Tiam1阳性转基因首建鼠(F0)繁育出390只F1、256只F2和573只F3代小鼠,最终获得13只纯合子；2、鉴定并筛选出结直肠Tiam1高表达而其它脏器Tiam1表达相对较低的雄性和雌性纯合子各一只(48A♀和48H♂),将其繁育建系,获得结直肠高表达Tiam1的纯合子稳定种群：3、通过DMH腹腔注射法成功建立了Tiam1转基因小鼠和野生型小鼠结直肠肿瘤模型。4、Tiam1转基因小鼠体内Tiam1过表达能够增强结直肠癌细胞增殖以及侵袭转移能力,但可能对小鼠结直肠癌的发生无明显影响,推测Tiam1过表达可能是结直肠癌生长、演进阶段的一个重要分子事件。本课题的特色与创新之处1、首建结直肠高表达Tiam1转基因小鼠稳定种群,为Tiam1的体内功能研究提供了遗传背景稳定、优质、可靠的转基因动物模型,具有广阔的应用前景。2、首次将Tiam1转基因小鼠与DMH诱导结直肠癌模型相结合,接近“真实”地再现了Tiam1在活体内促进肿瘤转移的作用模式,为探讨Tiam1在结直肠癌发生发展中的调控机制提供了一个全新的理想平台。3、实现了在活体内整体水平评估及验证Tiam1过表达具有促进结直肠癌细胞增殖以及侵袭转移的功能。