背景心肌肥厚是以心室肌增厚，室腔变窄为主要特征改变。导致心肌肥厚最常见的病因是高血压和心脏瓣膜狭窄。在细胞水平，心肌肥厚通常是由于心肌细胞体积增大和细胞骨架出现重构所致，而不是由心肌细胞增多引起。在分子水平，心肌肥厚主要表现为胎儿基因表达增加。在生理情况下，心肌肥厚是心脏对压力负荷的适应性反应。然而，心肌肥厚持续进展往往导致不良的预后，最终会导致心衰和猝死。到目前为止，心肌肥厚的病理生理机制仍不完全阐明，针对心肌肥厚的有效防治仍然比较局限。先前的研究表明，压力超负荷诱导的心肌肥厚促发了心肌细胞的自噬反应。此外，心肌细胞过度自噬会导致心肌细胞死亡。虽然，在真核细胞中，细胞生理水平上的自噬是必要的，因为细胞可以通过自噬反应清除体内有害的蛋白和细胞器进而维持自体代谢平衡。自噬不足或者过度均会导致疾病的病理进展。ATG9A是目前发现唯一完整的自噬泡膜蛋白，定位于自噬泡膜/自噬前体中，是自噬发生过程中的必须蛋白。另外，miRNAs是生物体内一类非编码小分子RNAs，能靶向结合基因3’-UTR互补的种子序列，在转录水平参与了基因表达的调控。要么分解mRNA，要么抑制相关基因蛋白的表达。miRNAs异常改变与心肌肥厚的进展相关。最近的研究发现，miRNAs在心脏的生长和生理起到重要的作用。例如，miR-34a是一个多功能调控子，通过调控相关靶基因的表达，涉及对细胞分裂、衰老、凋亡和增殖的调控。Cheng等人通过基因芯片技术证实miR-34a在小鼠肥厚的心脏组织中，其表达是失调控。但是，对于miR-34a如何调控心肌肥厚的机制仍不清楚。有实验证实miR-34a通过抑制ATG9A介导的自噬活性，进而调控漂亮新杆线虫的生长周期。我们也知道，血管紧张素II（AngiotensinII，AngII）是重要的生长因子，可介导心肌肥厚；其受体能调控心肌细胞的自噬活性。但是，仍不知道这些因子是否能在一起协同调控心肌肥厚？在AngII诱导的心肌细胞肥大中，ATG9A介导的自噬活性是否过度激活？同时，miR-34a能调控AngII诱导的心肌细胞肥大是否通过抑制ATG9A的表达来实现？为此，我们设想：miR-34a表达下调，导致ATG9A表达的增加，介导了心肌细胞自噬的过度激活，进而促进了心肌细胞肥大。本研究首先拟建立大鼠心脏肥厚模型，探测肥厚心脏组织中miR-34a和ATG9A表达以及自噬活性的变化，以阐明心肌肥厚中miR-34a与ATG9A以及自噬活性变化的关系。其次，通过建立体外心肌细胞肥大模型，研究miR-34a对靶基因ATG9A的调控变化，以及其改变在AngII诱导的心肌细胞肥大中的作用，进一步阐明miR-34a是通过靶向于ATG9A来调控自噬活性从而参与心肌细胞肥大的发生发展。我们希望通过明确这些新发现来帮助我们进一步了解心肌肥厚的分子机制，从而为未来针对心肌肥厚的防治提供有希望的作用靶点。第一部分大鼠肥厚心脏组织中自噬活性和ATG9A、miR-34a的改变目的探测压力超负荷诱导大鼠心肌肥厚的心脏组织中自噬活性、ATG9A和miR-34a的改变。方法通过对SD大鼠进行跨腹主动脉进行缩窄（TAAC）来构建心脏肥厚模型。经超声心动图测量室壁厚度和组织切片HE染色等明确造模成功。组织miR-34a和ATG9A的表达用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR，q-PCR）检测；自噬相关蛋白（ATG9A、p62和LC3II/I）用蛋白印迹（Western blot）进行检测，而心脏组织自噬泡的改变用透射电镜来观察。结果1.术后4周，多普勒超声心动图探测大鼠左室壁和腹主动脉。与假手术组大鼠比较，手术组大鼠左心室后壁收缩和舒张末期厚度（LVPWs和LVPWd）、室间隔收缩和舒张末期厚度（IVSs和IVSd）均明显增加；频谱多普勒显示：腹主动脉缩窄处血流充盈缺损、血流速度增快，压力阶差增高。2.与假手术组大鼠相比较，手术组大鼠大体心脏组织矢状切片HE染色示：室壁增厚，乳头肌和肉柱增粗。同时，心脏体重指数（HWI）增加。3.与假手术组大鼠相比较，手术组大鼠心脏组织局部切片HE染色示：心肌细胞增大、染色不均、着色浅，无核区多，肌纤维萎缩区域细胞核密度增加。ImagePro Plus软件测量心肌细胞表面积明显增大。4.与假手术组大鼠比较，手术组大鼠心脏ATG9A表达明显增加。5.与假手术组大鼠比较，手术组大鼠心脏自噬活性标记蛋白LC3II/I表达上调，而p62表达下调，同时自噬泡明显增多。6.与假手术组大鼠比较，手术组大鼠心脏组织miR-34a表达下调。小结1.大鼠肥厚心脏组织自噬相关蛋白ATG9A表达上调和自噬活性增高。2.大鼠肥厚心脏组织miR-34a表达下调。第二部分ATG9A与自噬活性的变化在AngII诱导心肌细胞肥大中的作用目的明确ATG9A与自噬活性的变化关系，以及它们在AngII刺激导致心肌细胞肥大中的作用。方法大鼠原代心肌细胞给予1μmol/LAngII刺激构建体外心肌细胞肥大模型。分别观察RNAi ATG9A和过表达ATG9A对心肌细胞自噬活性的影响。自噬活性通过Western blot检测自噬活性标志蛋白p62和LC3II/I的表达、流式细胞仪检测细胞自噬发生率和透射电镜观察心肌细胞自噬泡数量来评价；同时，用qRT-PCR检测肥厚基因表达和激光共聚焦观察心肌细胞形态的变化来评价心肌细胞肥大的改变。结果1.与对照组比较，原代心肌细胞给予AngII刺激组ATG9A表达明显上调的同时，肥厚相关基因β-MHC和ANP的表达也明显上调和细胞表面积增大。2.与对照组比较，AngII刺激组心肌细胞自噬活性标记蛋白LC3II/I表达上调，而p62表达下调。3.与对照组比较，AngII刺激组心肌细胞自噬率增加、自噬泡数量增多。4.与空载体组比较，过表达ATG9A组心肌细胞ATG9A的表达明显上调的同时，自噬活性标记蛋白LC3II/I表达上调，而p62表达下调。5.与阴性对照病毒组比较，阴性对照病毒+AngII组心肌细胞ATG9A的表达明显上调的同时，自噬活性标记蛋白LC3II/I表达上调，而p62表达下调。6.与阴性病毒+AngII组比较，ATG9A干扰病毒+AngII组心肌细胞ATG9A表达下调，自噬活性标记蛋白LC3II/I表达下调，而p62表达上调。7.与空载体组比较，过表达ATG9A组心肌细胞ATG9A的表达明显上调的同时，心肌细胞自噬率增加、自噬泡数量增多。8.与阴性对照病毒组比较，阴性对照病毒+AngII组心肌细胞自噬率增加、自噬泡数量增多。9.与阴性病毒+AngII组比较，ATG9A干扰病毒+AngII组心肌细胞自噬率下降、自噬泡数量减少。10.与空载体组比较，过表达ATG9A组心肌细胞肥厚相关基因表达增加的同时，心肌细胞表面积增大。11.与阴性对照病毒组比较，阴性对照病毒+AngII组心肌细胞肥厚相关基因表达上调的同时，心肌细胞表面积增大。12.与阴性病毒+AngII组比较，ATG9A干扰病毒+AngII组心肌细胞肥厚相关基因表达下调的同时，心肌细胞表面积减少。小结1.10-6mol/L AngII可刺激心肌细胞肥大，诱导ATG9A的表达和自噬活性的增加。2.过表达ATG9A可促进心肌细胞的自噬活性增加和肥大加剧。3.干扰ATG9A的表达能减轻AngII介导心肌细胞的自噬活性增加和肥大加剧。第三部分miR-34a与ATG9A的关系在AngII诱导心肌细胞肥大中的作用目的研究在心肌细胞中，miR-34a能否调控ATG9A介导的自噬活性而调控心肌细胞肥大。方法心肌细胞感染miR-34a过表达或抑制病毒后，共转染携带ATG9A3’-UTR的荧光素酶基因载体与内参载体，荧光素酶仪器检测荧光素酶活性的改变。同时，对miR-34a过表达或者抑制后，qRT-PCR和Western blot分别检测心肌细胞ATG9A基因与蛋白的表达变化。用qRT-PCR探测AngII刺激后心肌细胞miR-34a和肥厚相关基因表达的变化，而心肌细胞大小的变化用激光共聚焦进行观察。通过miR-34a过表达或者抑制，观察心肌细胞肥厚相关基因表达、细胞大少及心肌自噬活性的变化。结果1.与阴性病毒对照组比较，转染pGL3-ATG9A3’-UTR-Wild Type时，过表达miR-34a，荧光素酶活性下降了45%；抑制miR-34a表达，荧光素酶活性升高了0.38倍。2.与阴性病毒对照组比较，转染pGL3-ATG9A3’-UTR-Mutant Type时，过表达miR-34a或抑制miR-34a表达，荧光素酶活性无明显变化。3.与阴性病毒对照组比较，过表达miR-34a组或抑制miR-34a组，ATG9AmRNA表达无变化；然而，ATG9A的蛋白分别下调到0.62倍和上升到1.7倍。4.与阴性病毒组比较， AngII+阴性病毒组心肌细胞自噬率明显上调（11.27±0.61vs22.27±0.75，P<0.05）。5.与AngII+阴性病毒组比较，AngII+miR-34a过表达组心肌细胞自噬率明显下降（22.27±0.75vs12.47±0.35，P<0.05）。6.与阴性病毒组比较，AngII+阴性病毒组心肌细胞自噬泡数量明显增加（0.9±0.1vs2.4±0.31，P<0.05）。7.与AngII+阴性病毒组比较，AngII+miR-34a过表达组心肌细胞自噬泡数量明显减少（2.4±0.31vs1.62±0.4，P<0.05）。8.与阴性病毒组比较，AngII+阴性病毒组心肌细胞肥厚相关基因ANP和β-MHC表达上调，心肌细胞表面积增加。9.与AngII+阴性病毒组比较，AngII+miR-34a过表达组心肌细胞肥厚相关基因ANP和β-MHC表达下调，心肌细胞表面积减少。然而，与AngII+miR-34a干扰组比较，肥厚基因ANP和β-MHC表达上调，心肌细胞表面积增加。小结1. miR-34a与ATG9A基因的3’-UTR结合，调控其蛋白的表达。2. miR-34a在AngII诱导的心肌细胞肥大中表达明显下调。3. miR-34a上调可抑制AngII诱导心肌细胞的自噬活性。4. miR-34a调控AngII诱导的心肌细胞肥大。全文结论miR-34a可调控AngII诱导的心肌细胞肥大，而其调控作用是通过直接抑制ATG9A蛋白的表达和心肌细胞自噬活性来实现。