论文部分内容阅读
目的：探讨Ca2+感受蛋白基质相互作用分子1，2（STIM1,2）在人脐静脉内皮细胞（HUVEC）钙敏感受体（CaR）介导钙离子(Ca2+)内流和一氧化氮（NO）生成的作用和机制。国家自然科学基金（NO.31160239）方法：（1）胰蛋白酶消化法原代培养HUVEC，倒置显微镜下观察细胞形态及免疫细胞化学法检测Ⅷ因子对其进行抗原鉴定。（2）取2～5代HUVEC随机分组：①对照组；②CaR激动剂组(精胺+Ca2+)；③钙池操纵的钙离子通道（SOC）阻滞剂组(精胺+Ca2++MRS1836或+Gd3+或+2-APB或+SKF-9636)；④受体操纵的钙离子通道（ROC）阻滞剂组(精胺+Ca2++Ro31-8220与精胺+Ca2++Go6967)；⑤ROC阻滞剂+ROC激活剂组(精胺+Ca2++Ro31-8220+TPA与精胺+Ca2++Go6967+TPA)；⑥SOC阻滞剂+ROC阻滞剂组(精胺+Ca2++MRS1845+Ro31-8220或Go6967)；⑦STIM1shRNA处理组：未转染组（对照组）；干扰组：shSTIM1-002组、shSTIM1-003组、shSTIM1-004组；空质粒组（Vehicle组）；⑧STIM2shRNA处理组：未转染组（对照组）；干扰组：shSTIM2-001组、shSTIM2-002组、shSTIM2-003组；空质粒组（Vehicle组）。STIM1/STIM2shRNA处理组分别与含精胺+Ca2+（SOC和ROC均被激活）、含精胺+Ca2++CaR抑制剂Calhex231+ROC模拟剂OAG（阻断SOC，激活ROC）、含精胺+Ca2++PKC抑制剂Ro31-8220或+PKCs、PKCμ抑制剂Go6967（激活SOC，阻断ROC）的DMEM孵育20min（动态检测）。（3）针对GenBank中人来源STIM1、STIM2的cDNA序列设计并合成短发卡RNA（short hairpin RNA,shRNA），取2-5代HUVEC用脂质体法将shRNA转染入HUVEC。采用激光共聚焦显微镜观察细胞转染效率，Western blot方法检测STIM1、STIM2在各加药组中蛋白的表达及转染后的干扰效率，Real timeRT-PCR方法分别检测STIM1、STIM2mRNA表达及干扰效率。（4）免疫细胞化学技术检测STIM1、STIM2蛋白表达及定位。（5）荧光探针Fluo-2/AM负载测定细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的变化，NO荧光探针DAF-FM DA测定细胞内NO生成的变化。（6）实验数据用均数±标准误表示，组间比较用单因素方差分析，均数间的比较采用t检验或卡方检验。所有数据采用SPSS17.0统计软件包进行分析，以p<0.05表示差异有统计学意义。结果：（1）细胞形态学与免疫细胞化学法检测Ⅷ因子证实原代培养的细胞为HUVEC。（2）HUVEC细胞转染48h后，荧光显微镜下可见成功转染STIM1干扰质粒的细胞发出绿色荧光，成功转染STIM2干扰质粒的细胞发出红色荧光。（3）免疫细胞化学技术检测显示：STIM1、STIM2蛋白表达于胞浆，两者共定位于胞浆。（4）总蛋白Western blot检测结果显示：与对照组相比，各加药组STIM1、STIM2蛋白表达均无差异（P>0.05）。（5）STIM1/STIM2shRNA处理组Western blot检测结果显示：与Control组相比，Vehicle组无显著差异（p>0.05）；shSTIM1-002、shSTIM1-003、shSTIM1-004组STIM1蛋白表达都降低（干扰效率分别为43%、50%、74%）（p<0.05），尤其是shSTIM1-004组STIM1蛋白表达明显降低（p<0.05）；shSTIM2-001、shSTIM2-002、shSTIM2-003组STIM2蛋白表达都降低（干扰效率分别为44%、80%、30%）（p<0.05），尤其是shSTIM2-002组STIM2蛋白表达明显降低（p<0.05）。（6）Realtime RT-PCR检测结果显示：与Control组相比Vehicle组无显著差异（p>0.05）；shSTIM1-002、shSTIM1-003、shSTIM1-004组STIM1mRNA表达均降低（干扰效率分别为56%、73%、91%）（p<0.05），尤其是shSTIM1-004组STIM1mRNA表达明显降低（p<0.05）；shSTIM2-001、shSTIM2-002、shSTIM2-003组STIM2mRNA表达亦均降低（干扰效率分别为80%、88%、41%）（p<0.05），尤其是shSTIM2-002组STIM2mRNA表达明显降低（p<0.05）。（7）HUVEC中[Ca2+]i荧光变化值结果如下：与Control组(精胺+Ca2+组，Δratio=5.84±0.10)相比Vehicle组（Δratio=5.80±0.05）无显著差异（p>0.05）；shSTIM1-004组（Δratio=4.60±0.18）[Ca2+]i△ratio值明显降低（p<0.05）； shSTIM2-002组（Δratio=5.75±0.13）无显著差异（p>0.05）。与Control组(精胺+Ca2++CaR抑制剂Calhex231+ROC模拟剂OAG组，Δratio=2.79±0.04)相比Vehicle组（Δratio=2.91±0.18）无显著差异（p>0.05）；shSTIM1-004组（Δratio=1.09±0.02）[Ca2+]i△ratio值明显降低（p<0.05）。与Control组(精胺+Ca2++PKC抑制剂Ro31-8220组，Δratio=3.15±0.10)相比Vehicle组（Δratio=2.90±0.08）无显著差异（p>0.05）；shSTIM1-004组（Δratio=1.15±0.02）[Ca2+]i△ratio值明显降低（p<0.05）。与Control组(精胺+Ca2++PKCs、PKCμ抑制剂Go6967组，Δratio=4.26±0.04)相比Vehicle组（Δratio=4.17±0.14）无显著差异（p>0.05）；shSTIM1-004组（Δratio=1.21±0.07）[Ca2+]i△ratio值明显降低（p<0.05）。（8）HUVEC中NO生成的结果如下：与Control组(精胺+Ca2+组)（1105.18±31.97）相比Vehicle组（983.33±30.33）无显著差异（p>0.05）；shSTIM1-004组（160.08±11.12）NO净荧光强度值明显降低（p<0.05）；shSTIM2-002组（1035.80±27.78）NO净荧光强度值无显著差异（p>0.05）。与Control组(精胺+Ca2++CaR抑制剂Calhex231+ROC模拟剂OAG组)（177.17±20.09）相比Vehicle组（179.92±16.82）无显著差异（p>0.05）；shSTIM1-004组（59.83±7.43）NO净荧光强度值明显降低（p<0.05）。与Control组(精胺+Ca2++PKC抑制剂Ro31-8220组)（182.66±11.93）相比Vehicle组（175.52±31.64）无显著差异（p>0.05）；shSTIM1-004组（56.27±5.71）NO净荧光强度值明显降低（p<0.05）。与Control组(精胺+Ca2++PKCs、PKCμ抑制剂Go6967组)（201.43±7.48）相比Vehicle组（188.19±19.77）无显著差异（p>0.05）；shSTIM1-004组（56.06±7.71）NO净荧光强度值明显降低（p<0.05）。结论：（1） STIM1在CaR介导Ca2+内流和NO生成中起着重要作用。（2）STIM1为CaR介导Ca2+内流及NO生成中的关键分子组件；STIM2没有参与上述过程。