[研究背景]脑卒中在全球范围内是仅次于缺血性心脏病的第二大致死原因。随着中国经济发展和生活方式的改变,脑卒中已成为我国国民的第一致死疾病,其中缺血性脑卒中占到了卒中总数的69.6%-77.8%,给社会和家庭带来严重损失和沉重经济负担。急性脑卒中主要治疗方式还是早期rt-PA溶栓或机械取栓使得血管再开通。但受制于3-4.5 h较短的时间窗,和血管再通后缺血再灌注损伤带来的脑水肿、颅内出血和出血转化等并发症,其治疗效率有待进一步提升。寻找合适的神经保护剂治疗脑缺血再灌注损伤配合早期的血管开通是近年来的治疗急性缺血性脑卒中的研究热点之一。脑缺血再灌注损伤主要发病机制包括能量耗竭、炎性反应、氧自由基损伤、钙离子超载、一氧化氮和一氧化氮合酶的作用、兴奋性氨基酸毒性以及血脑屏障破坏及细胞坏死调亡等。其中,血脑屏障破坏和炎性反应在缺血再灌注病理过程中起到关键作用。小胶质细胞作为神经血管单元的组成细胞,在维持血脑屏障结构完整和功能维持以及神经炎症的启动和调控方面都起到了重要作用。天麻素是传统中药天麻的主要有效单体成分之一,目前在临床应用广泛,可通过抗氧化应激、抗神经炎性反应、调节神经递质、调节神经重构、抗凋亡抗自噬等多途径在多种神经系统疾病中发挥神经保护作用。目前关于天麻素在缺血再灌注损伤中对血脑屏障的保护和对小胶质细胞缺血再灌注损伤导致的神经炎症的调控机制现在尚未有深入研究。因此,本研究通过构建体内外缺血再灌注模型,研究天麻素对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经行为、梗死体积的保护作用,评估天麻素对血脑屏障及相关蛋白的影响,从细胞层面探讨天麻素对小胶质细胞在缺血再灌注损伤导致的神经炎症的调控和机制。为缺血性脑卒中的治疗提供一个新的可能治疗靶点和治疗思路。第一部分天麻素预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[目 的]本实验部分建立SD大鼠缺血再灌注体内实验模型和BV-2小胶质细胞OGD/R体外模型,通过天麻素预处理,观察天麻素对缺血再灌注损伤大鼠的神经行为、梗死体积、脑含水量的作用,评估天麻素对血脑屏障影响,研究天麻素在体内外小胶质细胞中对血脑屏障损伤相关蛋白的调控。[方 法]通过线栓法制作SD大鼠MCAO模型来建立缺血再灌注体内实验部分动物模型;通过BV-2小胶质细胞氧糖剥夺再灌注在体外模拟细胞缺血再灌注损伤过程。使用各剂量天麻素(体内50mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg,体外20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L)预处理,并同阳性对照尼莫地平(NIM)及阴性对照组比较。使用Garcia JH评分评估各组神经行为学变化;使用TTC染色测量脑组织梗死体积,通过测量脑组织EB渗漏量和脑组织含水量以及HE染色检测反映血脑屏障通透性的变化,通过Western blot和免疫荧光染色检测各组大鼠脑组织和小胶质细胞中基质金属蛋白酶-2(MMP2)和基质金属蛋白酶-9(MMP9),以及水通道蛋白-4(AQP4)和闭锁小带蛋白-1(ZO-1)的变化。[结 果]1.不同浓度GAS和NIM预处理的MCAO大鼠神经功能评分较MCAO组明显改善(P<0.001)。各治疗组中GAS 100mg/kg组评分最高。2.同MCAO组相比,GAS 100 mg/kg组和GAS 200 mg/kg组脑组织梗死体积明显减少(P<0.001)。3.MCAO组EB的渗漏明显增加,天麻素各治疗组和NIM组的EB渗漏量较MCAO组明显减少(P<0.01,P<0.001)。其中GAS 100 mg/kg组减少趋势最明显。4.MCAO组脑组织含水量明显升高,GAS 100 mg/kg能明显降低IRI脑组织含水量(P<0.01)。5.Western blot结果显示MCAO组IRI72 h后MMP2和MMP9、AQP4的表达显著增加(P<0.01),而ZO-1的表达减少(P<0.01),同时在 GAS 治疗(100mg/kg)组和 NIM 治疗(4mg/kg)组中 MMP2和MMP9、AQP4的表达较MCAO组显著减少(P<0.01),而ZO-1的表达增加。免疫荧光显示在脑组织小胶质细胞中也有类似的趋势。6.Western blot显示BV-2细胞OGD/R各时间点中3 h和6 h时间点各蛋白变化程度最明显,GAS 40μmol/L、80 μmol/L在3 h时均能抑制MMP2和MMP9、AQP4在OGD/R后升高趋势,同时能增加ZO-1的表达。[结 论]1.SD大鼠脑缺血后再灌注72h时间点仍存在神经功能缺损,血脑屏障通透性增加和脑含水量增加。2.天麻素预处理能明显改善MCAO大鼠再灌注72 h时的神经功能,减少脑梗死体积和血脑屏障通透性。3.天麻素100mg/kg在大鼠体内和40 μmol/L在体外能抑制小胶质细胞MMP2,MMP9和AQP4,增加ZO-1表达从而发挥其在MCAO和OGD/R模型中对缺血再灌注损伤的保护作用。第二部分天麻素对缺血再灌注损伤后小胶质细胞中SOX4的调控[目 的]本实验部分通过构建缺血再灌注损伤动物模型及细胞模型,使用Western blot及免疫荧光观察检测缺血再灌注损伤后体内体外小胶质细胞中SOX4蛋白变化。同时通过天麻素干预缺血再灌注损伤动物模型及细胞模型,探讨研究天麻素对小胶质细胞中SOX4表达的影响。并用天麻素干预SOX4过表达的BV-2细胞,检测SOX4过表达BV-2细胞中MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1表达的变化,研究天麻素对缺血再灌注损伤的保护机制。[方 法]通过线栓法制作SD大鼠建立脑缺血再灌注动物模型;提取和纯化大鼠原代小胶质细胞并培养传代;通过BV-2小胶质细胞和原代小胶质细胞OGD/R在体外模拟缺血再灌注损伤过程。将实验动物和细胞分为对照组,模型组和天麻素干预组,体外部分分别使用GAS50mg/kg、GAS 100mg/kg、GAS200 mg/kg,体内部分分别使用 GAS 20 μmol/L、GAS 40 μmol/L、GAS 80 μmol/L 对实验模型将进行预处理。通过Western blot和免疫荧光染色检测各组大鼠脑组织和两种小胶质细胞株中SOX4的基础表达,和在MCAO、OGD/R刺激后以及GAS干预后SOX4的表达变化。构建SOX4过表达和空载的质粒,用慢病毒载体系统包装带有GFP荧光标记的SOX4过表达质粒和对照空载质粒,建立SOX4慢病毒稳定感染BV-2细胞系和对照空载病毒稳定感染BV-2细胞系。天麻素干预转染细胞系OGD/R模型,Western blot和免疫荧光染色检测SOX4,MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1表达的变化。[结 果]1.SOX4蛋白在BV-2永生小胶质细胞株和新生SD大鼠原代小胶质细胞中有基础表达,在SD大鼠胼胝体区小胶质细胞中也有少量表达。2.Western blot结果显示MCAO组IRI72 h后脑组织SOX4的表达增加(P<0.01);同时GAS 100 mg/kg和GAS 200 mg/kg治疗可抑制SOX4增加的趋势,以100 mg/kg组明显。免疫荧光显示在脑组织小胶质细胞中也有类似的趋势。3.Western blot显示BV-2细胞和原代小胶质细胞中OGD/R后各时间点中3h时间点SOX4升高程度最明显,GAS 40 μmol/L能抑制OGD/R后3 h时SOX4升高趋势。4.GAS 40 μmol/L预处理能减少OGD/R BV-2小胶质细胞中SOX4、MMP2和MMP9、AQP4表达并且增加ZO-1的表达。在SOX4过表达细胞系中,GAS 40μmol/L预处理不能减少MMP2、MMP9、AQP4和增加ZO-1的表达。[结论]1.SOX4蛋白在BV-2永生小胶质细胞株和新生SD大鼠原代小胶质细胞中有基础表达,在SD大鼠胼胝体区小胶质细胞中也有少量表达。2.OGD/R以及MCAO能明显增加SOX4在体内外小胶质细胞中的表达,天麻素预处理能抑制SOX4增高的趋势。3.SOX4过表达能逆转GAS对OGD/R小胶质细胞中MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1的影响,提示GAS可通过SOX4调控MMP2和MMP9、AQP4、ZO-1进而发挥神经保护作用。