脓毒症是宿主对感染的反应失调引起的致命性的器官功能障碍,是机体促炎和抗炎反应的早期激活进而出现的一系列如心血管、激素、代谢、出凝血、神经等非免疫途径的改变,是严重创伤、烧伤、感染、大手术后等常见的并发症,若进一步发展,可导致脓毒性休克甚至死亡。脓毒症是感染患者致死致残的重要因素,是严重威胁公共健康的主要问题之一。尽管近年来抗生素应用和重症监护支持治疗技术不断发展,但人口老龄化、免疫抑制剂的应用、放疗、化疗等原因导致脓毒症的发病率仍在增加,死亡率居高不下。即使患者没有死于脓毒症,多数患者也将会存在长期的生理、心理异常及认知功能障碍,且之后再感染的风险增加,严重影响患者的生活质量。随着脓毒症流行病学、病理学及脓毒症患者的管理等方面研究的不断深入,人们对脓毒症的本质有了更深层次的理解。目前,大家认为脓毒症是机体对感染的反应失调导致的,它损伤了自身组织甚至威胁生命。脓毒症患者的预后和器官衰竭程度有直接关系。然而,脓毒症引起器官功能障碍的病理生理学机制远较感染及其伴随的炎症反应复杂。尽管细胞坏死广泛存在于各种疾病中且既可以作为疾病发生的原因也可以作为疾病造成的结果,但是传统上坏死被认为是一种被动的不受调控的细胞死亡方式,因此,人们对于其发生机制并没有进行深入的探讨。华人科学家袁钧瑛于2005年发现了一种可被调控的细胞坏死—受体相互作用蛋白激酶(RIP)介导的坏死,即程序性坏死。这种细胞死亡方式的发现颠覆了以往人们对于坏死的理解。同时,它为调控细胞生存和死亡的研究打开了新的视野。已有报道,死亡受体家族的配体(TNF-α,FASL,TRAIL等),Toll样受体(TLR3/4)及病毒介导的DNA依赖干扰素调节因子激活剂(DAI)可通过不同的通路介导程序性坏死的发生。其中,RIP1在TNF-α介导的NF-κB通路激活、凋亡和程序性坏死中起到关键性的作用。具有激酶活性的RIP1可募集RIP3并与之相互磷酸化,磷酸化的RIP3与MLKL形成复合体并转移到细胞膜,导致细胞膜上的离子通道开放,细胞通透性增强,最终细胞肿胀破裂。已经证实Necrostatin-1(Nec-1)是程序性坏死特异性的抑制剂。作为RIP1的变构抑制剂,Nec-1不影响RIP1介导激活NF-κB通路,但是能够特异性的抑制RIP1的激酶活性,抑制RIP1-RIP3相互磷酸化,阻断坏死体的形成。RIP1作为程序性坏死通路中非常重要的靶点,Nec-1被广泛的应用于各种疾病模型。研究发现,Nec-1通过抑制程序性坏死改善了脑、心脏、肾脏等器官缺血再灌注损伤,创伤性的脊髓损伤,视网膜病变和神经退行性病变等。尤为重要的是,我们预实验发现盲肠套扎穿孔的大鼠脓毒症模型肝脏细胞存在程序性坏死。因此,我们假设在脓毒症时给予程序性坏死的特异性抑制剂Nec-1,它通过抑制器官实质细胞发生程序性坏死,从整体上减少细胞死亡,保护器官功能,减轻脓毒症时多器官功能障碍,最终减少脓毒症的死亡率,为临床上探索脓毒症的发病机制和治疗方法提供新的思路。方法第一部分 Necrostatin-1对脓毒症大鼠生存时间的影响复制CLP诱导的脓毒症大鼠模型。本部分实验分为三组:假手术对照组(sham组),CLP+生理盐水组(CLP+NS组)和CLP+Nec-1组。实验组大鼠均在CLP前20分钟分别经尾静脉缓慢给予生理盐水和Nec-1(1.65mg/Kg·d)。分别于CLP术后6h、12h和18h提取大鼠的肝、肾、肺组织蛋白,应用蛋白免疫印迹技术检测各组RIP1、RIP3和MLKL的表达,分别免疫沉淀RIP1和RIP3,检测二者的相互募集以及它们分别对MLKL的募集情况,并观察和记录各组大鼠的生存时间和72小时生存率。第二部分 抑制程序性坏死对脓毒症大鼠肝脏细胞凋亡的影响复制CLP诱导的脓毒症大鼠模型。本部分实验分为四组:假手术对照组(sham 组),假手术+Nec-1 组(sham+Nec-1 组),CLP+生理盐水组(CLP+NS组)和CLP+Nec-1组。实验组大鼠均在CLP前20分钟分别经尾静脉缓慢给予生理盐水和Nec-1(1.65mg/Kg·d)。分别于CLP术后6h、12h和18 h提取大鼠血清和制作肝组织病理切片,观察各组大鼠血清ALT和AST水平变化和肝脏组织病理的动态变化。接着对大鼠肝脏组织进行TUNEL染色并提取大鼠肝脏蛋白,应用蛋白免疫印迹技术检测各组caspase3、cleaved caspase3、Bcl-2和Bax的表达,从组织学水平和蛋白水平检测细胞凋亡。结果第一部分 Necrostatin-1对脓毒症大鼠生存时间的影响1.Nec-1对CLP诱导的脓毒症大鼠肝、肾和肺组织程序性坏死的影响在CLP术后6h,大鼠肝脏组织RIP1、RIP3和MLKL的表达就已经明显升高,分别较 sham 组增加了 4.99±2.54 倍(P<0.05)、2.83±0.34 倍(P<0.01)和1.51±1.69倍(P<0.05)。在CLP术后12 h和18 h三种蛋白的表达也均高于sham组,且具有明显差异。在给予Nec-1后,我们发现CLP术后6 h,大鼠肝脏组织RIP1、RIP3和MLKL的表达明显下调,分别较CLP+NS组下降了 89.1±94.1%(P<0.05)、67.8±78.8%(P<0.05)和 68.2±56.4%(P<0.05)。在 CLP术后12 h和18 h这三种蛋白的表达同样受到了明显抑制。分别免疫沉淀RIP1和RIP3,通过检测二者的相互募集以及它们分别对MLKL的募集情况发现,Nec-1处理组RIP1与RIP3的结合程度及它们对MLKL的募集程度均显著低于CLP+NS组。而CLP术后肾脏和肺脏组织三种程序性坏死特征性蛋白并没有明显的升高,与sham组表达无明显差异。以上结果证实,CLP诱导的脓毒症大鼠肝脏细胞存在程序性坏死,Nec-1可有效抑制其程序性坏死的发生。2.Nec-1对CLP诱导的脓毒症大鼠生存时间的影响所有sham组大鼠生存时间均超过72 h,CLP+NS组大鼠的生存时间较sham组明显下降,为52.16±21.67 h,72 h生存率为5/12(P<0.01)。给予Nec-1后,CLP+Nec-1组大鼠的生存时间较CLP+NS组继续下降,为30.17±10.68 h,72 h生存率为0/12(P<0.01)。给予Nec-1抑制程序性坏死后,不仅没有对CLP诱导的脓毒症的大鼠产生保护作用,反而加速了动物的死亡。第二部分抑制程序性坏死对脓毒症大鼠肝脏细胞凋亡的影响1.抑制程序性坏死对CLP诱导的脓毒症大鼠肝功能的影响给予sham组大鼠Nec-1后肝功能(ALT和AST水平)较sham组无明显差异,说明Nec-1并没有对正常肝组织功能产生不利的影响。CLP术后6 h,CLP+NS组大鼠血清ALT和AST水平由sham组的33.3±11.9 U/L和78.7±17.7 U/L明显增加为 76.3± 14.6 U/L 和 160.0±12.5 U/L(P 均<0.01),而 CLP+Nec-1 组分别为91.7±11.7U/L和 190.0±11.0 U/L,AST 水平较 CLP+NS 组差异明显(P<0.05)。CLP术后12 h,CLP+NS组大鼠血清ALT和AST水平为131.3±20.0 U/L和286.33±23.16 U/L,较 sham 组的 38.7±11.5 U/L 和 86.7±20.6 U/L 显著增加(P均<0.01),而 CLP+Nec-1 组分别为 164.3±17.8 U/L 和 329.67±26.5 U/L,较 CLP+NS组结果差异明显(P均<0.05)。CLP术后18 h,CLP+NS组大鼠血清ALT和AST水平由 sham 组的 42.3±23.2 U/L 和 93.3±27.6 U/L 显著增加为 211.7±25.5 U/L 和491.0±30.1 U/L(P均<0.01),而 CLP+Nec-1 组则继续增加为 257.7±24.2 U/L 和561.0±45.177 U/L(P 均<0.05)。2.抑制程序性坏死对CLP诱导的脓毒症大鼠肝脏组织病理的影响sham+Nec-1组大鼠肝脏组织结构正常,无明显的病理改变,说明Nec-1对正常组织没有明显的毒性作用。在CLP术后6 h,肝脏出现了轻微的形态学改变,包括:肝细胞肿胀、汇管区水肿。CLP术后12 h,损伤加重,汇管区中性粒细胞浸润,Kupffer细胞增生肥大,汇管区狭窄,胞核浓缩,胞浆嗜酸性增强。CLP术后18 h,出现了分散的细胞坏死,病理评分较sham组显著升高(P<0.05)。而CLP+Nec-1组在CLP术后6 h已经出现了明显的肝细胞肿胀和气球样变,随着时间延长肝细胞受损越来越严重,大量肝细胞坏死。CLP术后12 h和18 h病理评分分别为2分(1.80±0.45)、3分(2.80±0.45)分别较CLP+NS组的1分(1.40±0.55)、2 分(2.40±0.55)明显增加(P<0.05 或 P<0.01)。以上结果与肝功能检测结果相符。3.抑制程序性坏死对CLP诱导的脓毒症大鼠肝组织细胞凋亡的影响TUNEL染色结果显示:sham组和sham+Nec-1组大鼠肝组织中几乎不存在TUNEL 阳性细胞,说明在损伤程度较小的假手术组几乎不会出现细胞凋亡。在CLP术后6 h、12 h和18 h,CLP+Nec-1组大鼠肝脏组织每个视野的TUNEL阳性细胞数分别为CLP+NS组的1.5倍(P<0.05)、1.9倍(P<0.01)和1.4倍(P<0.01)。此结果提示,抑制程序性坏死,CLP诱导的脓毒症大鼠肝脏在组织学水平检测,细胞凋亡增加。Western Blot检测caspase3表达的结果,与TUNEL染色结果相一致。sham+Nec-1组caspase3和cleaved caspase3的表达与sham组这两种蛋白的表达相比较,结果无明显差异(P均>0.05)。在CLP术后6 h和12 h,CLP+NS组caspase3的表达分别为sham组的6.6倍和4.2倍(P均<0.01)。CLP+Nec-1组caspase3在这两个时间点的表达较CLP+NS组分别减少了 58.1%和82.6%(P均<0.01),但是CLP+Nec-1组cleaved caspase3在这两个时间点的表达量分别为CLP+NS组的2.1倍和2.3倍(6 h,P<0.01;12 h,P<0.05)。这一结果说明CLP+Nec-1 组减少的 caspase3 已经转变为 cleaved caspase3。在 CLP 术后 18 h,CLP+Nec-1组caspase3和cleaved caspase3的表达均明显升高,分别为CLP+NS组的 1.9 倍和 5.1 倍(P<0.05;P<0.01)。4.抑制程序性坏死对CLP诱导的脓毒症大鼠肝脏细胞线粒体凋亡途径的影响CLP术后,大鼠肝脏的Bcl-2表达较sham组明显减少(CLP术后12 h和18 h,P均<0.01)。但是给予Nec-1后,Bcl-2的表达量较CLP+NS组继续减少(CLP术后12 h和18 h,P均<0.05)。促凋亡蛋白Bax的表达情况与Bcl-2正好相反。CLP+NS组Bax的表达较sham组明显增加(CLP术后6 h,P<0.01;12 h,P<0.05;18 h,P<0.01),然而跟 CLP+NS 组相比较,CLP+Nec-1 组 Bax的表达多,且在三个时间点均具有明显差异(P均<0.01)。结论1.CLP诱导的脓毒症大鼠肝脏细胞存在程序性坏死,Necrostatin-1可有效的抑制其程序性坏死的发生。2.Necrostatin-1抑制程序性坏死加速了 CLP诱导的脓毒症大鼠的死亡。3.Necrostatin-1抑制程序性坏死恶化了 CLP诱导的脓毒症大鼠的肝功能和肝脏病理。4.Necrostatin-1抑制程序性坏死增加了 CLP诱导的脓毒症大鼠肝脏细胞的凋亡,且细胞凋亡方式可能为线粒体途径的细胞凋亡。