GPR49基因对肝癌细胞增殖侵袭能力的影响

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研究背景:  肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,以下简称肝癌或HCC)占原发性肝癌90%以上,在全球癌症发病率中居第5位,死亡率居第3位。中国是肝癌高发区,尽管肝癌的诊断和治疗取得了较大的进展,但疗效仍然较差[1]。肝癌切除术后5年生存率为24%~50%,肝移植术后5年生存率也仅为47%~61%[2];肝癌对全身化疗与放疗的疗效差[3,4]。目前,肝癌的分子靶向治疗取得了令人鼓舞的结果,多靶点、多激酶抑制剂Sorafenib用于不能手术切除的晚期肝癌患者,可延长总体生存期近3个月[5,6]。因此,进一步阐明肝癌的发病机制,寻找更高效、高选择性的治疗靶点,对于提高肝癌疗效具有重要的临床意义[7]。  肝脏的胚胎发生以及成熟过程中Wnt信号通路发挥重要作用,且对肝脏代谢功能调控也是必需的[8]。正常肝组织中β-catenin几乎全部定位于细胞膜上,细胞核未见表达;肝硬化组织中β-catenin细胞膜的缺失率和细胞质的异位表达率均显著高于正常肝组织;肝癌的癌组织中β-catenin在细胞膜的缺失率和细胞质的异位表达率均高于正常肝组织和肝硬化组织。HBV的病毒调节蛋白HBX参与肝细胞瘤细胞内Wnt/β-catenin信号的活化,伴随 Wnt-1的 HBX异位表达通过稳定胞质β-catenin,活化Huh7细胞内的Wnt/β-catenin信号[9]。  目前对 Wnt/β-catenin信号通路异常在肝癌发生和转移过程中最为关键的靶基因研究不多。日本东京癌症研究所在对人肝癌组织及肝癌细胞系研究发现[10]:β-catenin外显子3在 HCC组织中具有突变,这种突变常伴有一种 G蛋白配对受体 GPR49过度表达,其发生率为87.5%(14/16)。经实时定量RT-PCR检测,47%(18/38)肝癌组织内GPR49过度表达高出癌旁组织3倍。将突变的β-catenin转入小鼠培养的肝细胞可引起GPR49上调。因此,GPR49是Wnt/β-catenin信号通路被活化后的下游靶基因之一。  研究目的:  探讨原发性肝癌(肝癌)细胞系Huh7细胞中G蛋白偶联受体49(GPR49)基因对肝癌细胞侵袭能力的影响及其分子生物学机制。  研究方法:  根据转染的小干扰 RNA(si-RNA)不同,将 Huh7细胞分为 GPR49-siRNA(si-GPR49)组和阴性对照 NC-siRNA(si-NC)组,另设未转染 Huh7细胞为对照组(control组)。采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法和Western blot法分别检测3组细胞GPR49、细胞周期素D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)的信使核糖核酸(mRNA)和蛋白的表达。采用MTT法和Transwell法分别检测各组细胞增殖能力和侵袭能力。  采用SPSS16.0软件进行统计分析。P<0.05为显著性检验的标准。  实验结果  si-GPR49组GPR49 mRNA的相对表达量为control组的(23.8±3.1)%(P<0.05)。与control组相比,si-GPR49组GPR49、cyclin D1、MMP9蛋白的表达量明显降低(均为 P<0.05)。MTT检测细胞增殖能力实验结果显示,si-GPR49组细胞在72 h的吸光度(OD)值(0.53±0.12)明显低于control组的(1.35±0.28),差异有统计学意义(P<0.05)。si-GPR49组平均穿膜细胞数为(13.6±2.5)个,明显低于 control组的(65.3±6.1)个,差异有统计学意义(P<0.05)。  研究结论:  GPR49-siRNA可抑制Huh7细胞GPR49基因表达,其机制可能是通过降低cyclin D1水平抑制 Huh7细胞的增殖能力,通过影响 MMP9蛋白表达水平抑制 Huh7细胞的迁移和侵袭能力。
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