癌症严重威胁人类健康,成为目前仅次于心血管疾病的第二大“杀手”,因此相应的治疗手段以及抗癌药物的开发迫在眉睫。研究发现,约50%的肿瘤中均出现p53基因的突变,而在表达野生型p53基因的肿瘤中,也发现p53的活性受到其负向调节蛋白的抑制。MDM2及其同源蛋白MDMX是p53的两种负调节蛋白,两者通过不同的作用机制对p53的活性产生抑制作用。MDM2可通过多种途径抑制p53的活性:1)MDM2作为泛素家族的成员,通过促进p53的泛素化过程,进而加速p53的降解;2)与p53的N末端结合,抑制p53的转录活性;3)将p53从细胞核递送到细胞质中,使p53无法与靶DNA结合进而导致p53失去抑癌活性。MDMX则是通过与p53结合,形成无活性的p53-MDMX复合物,同时可以抑制p53的反式激活,导致p53失去抑制肿瘤细胞生长的活性。因此,通过开发能有效抑制MDM2和MDMX的药物,是治疗p53通路相关肿瘤的重要切入点,但由于MDM2/MDMX两者结构上的细微差异,为开发能同时调控p53-MDM2/p53-MDMX相互作用的抑制剂提出了巨大的挑战。根据晶体结构显示,p53与MDM2和MDMX通过蛋白-蛋白相互作用（PPI）结合,p53的N末端插入MDM2和MDMX的疏水口袋。值得注意的是,结合时,p53序列中的3个氨基酸残基（Phe-19,Trp-23,Leu-26）发挥着关键的作用。因此,模拟p53与MDM2/MDMX的蛋白-蛋白相互作用,是开发抑制p53-MDM2和p53-MDMX相互作用拮抗剂的重要依据。目前针对MDM2和MDMX的靶点抑制剂包括非肽类小分子抑制剂和多肽类抑制剂。由于小分子药物的分子体积较小,难以通过PPI发挥作用,并且目前开发的大多数小分子抑制剂仅能与MDM2结合,较少存在与MDMX结合的能力,导致其抑制活性难以达到理想的效果。多肽类药物由于具有活性广泛、靶点明确、系统毒性低等优势,使其成为肿瘤药物开发的热点。随着蛋白组学和基因组学的发展,研究者们对活性多肽以及多肽药物的替代疗法产生了浓厚兴趣。随着噬菌体展示技术的发展,分离出对MDM2和MDMX具有双重抑制作用的多肽PDI,开辟了p53-MDM2/MDMX双靶点药物开发的道路。多肽也存在一些固有的缺点,如蛋白水解酶稳定性和膜渗透性较差等,限制了多肽药物向临床转化的潜力。因此研究者们针对活性多肽进行药物化学改造,比如通过引入非天然氨基酸、D-型氨基酸、氮杂氨基酸等避免蛋白水解酶的天然识别,增强多肽对蛋白酶的抗性,进而提高多肽的稳定性;通过对多肽进行环化,如引入订书针结构,可以增强多肽结构的刚性,并提高多肽的细胞膜渗透性;还可以通过引入细胞穿膜肽（Cell penetrating peptide,CPP）的策略来增强其细胞穿膜能力。本文选取对MDM2/MDMX具有双重靶向作用的PDI（LTFEHYWAQLTS）作为模板肽进行化学修饰。首先考虑PDI发挥作用的关键氨基酸残基,在PDI的i/i+4或i/i+7位置进行氮杂氨基酸替换,并对氮杂氨基酸的Nα-H用不同的烯醇进行烷基化修饰,最后通过烯烃复分解反应闭环,形成氮杂订书针结构。最后成功合成3条氮杂订书针肽类似物:ZH-SPDI-48、ZH-SPDI-59、ZH-SPDI-411,对其进行分离纯化,并采用圆二色谱对其二级结构进行表征,发现3条氮杂订书肽类似物的α-螺旋程度呈现不同程度的降低。随后对氮杂订书针肽的抗肿瘤活性进行评价,通过考察氮杂订书针肽类似物与MDM2和MDMX两种蛋白的结合亲和力,发现基于PDI修饰之后的氮杂订书针肽类似物可保持或提高其蛋白结合亲和力,且i/i+7位改造的氮杂订书针肽（ZH-SPDI-411）结合能力最强。随后考察了氮杂订书针肽类似物在不同肿瘤细胞中抑制肿瘤细胞增殖的能力,发现其抑制活性与MDM2/MDMX蛋白结合亲和力的结果一致,抗肿瘤活性均高于模板肽PDI,其中ZH-SPDI-411的活性提高最为明显,通过激光共聚焦探究氮杂订书针肽的细胞内定位,发现ZH-SPDI-411的细胞膜渗透性明显优于模板肽PDI。最后在肾皮质细胞（293T）中探究氮杂订书针肽的细胞毒性,结果表明其细胞毒性无明显增加。通过氮杂和订书针策略改造有助于提高多肽的稳定性、生物活性和细胞膜渗透性,且进一步证明多肽序列中α-螺旋程度与其抗肿瘤活性不存在必然联系。综上所述,我们成功开发了一种新型的多肽修饰策略,并在MDM2/MDMX双靶点抑制剂PDI中验证了该方法的可行性,该方法可以广泛应用于其他活性多肽的修饰中,为多肽化合物库的构建奠定了基础。同时,该策略显著提高了PDI的抗肿瘤活性,有望为筛选多肽抗肿瘤先导化合物及抗肿瘤多肽药物的开发贡献力量。