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生物节律,是生物在长期进化过程中形成的随时间变化表现出的周期性活动,例如:日节律—生物钟,年节律—迁徙、洄游等。生物钟系统调控生物体的各项生理、行为和各种生化反应过程。大量研究表明生物钟系统不仅调控生物的生物节律,也调控机体的免疫系统。目前,对于生物钟系统的研究主要集中在生物节律行为和对免疫系统影响的研究。鉴于中华绒螯蟹是昼伏夜出和洄游物种,本研究从隐花色素和铁硫簇组装蛋白两个分子入手,利用生物信息学、分子生物学和免疫学等手段,初步探究生物钟蛋白隐花色素和铁硫簇组装蛋白在中华绒螯蟹免疫调控中的作用。作为一种光受体蛋白,隐花色素通过节律性表达调控生物体的生物钟系统。大量研究表明,生物节律与免疫系统紧密联系、相互影响。隐花色素能通过影响生物钟系统来调控机体的免疫系统。本研究在中华绒螯蟹体内发现了一个隐花色素蛋白(命名为EsCry)。通过RACE基因克隆技术得到EsCry2的全长序列1662 bp,其中开放阅读框为1518 bp,编码505个氨基酸,5’非编码区长132 bp,3’非编码区长132 bp。通过SMARTER软件分析,该氨基酸序列含有一个典型的DNA光裂合酶结构域和一个典型的FAD结合位点结构域。序列比对发现EsCry与小鼠、斑马鱼、果蝇、长牡蛎等物种的隐花色素序列相比,相似性超过60%。利用MEGA6软件以及基于NCBI数据库已有的物种的氨基酸序列构建系统进化树,结果显示Cry能分成5大支,EsCry与脊椎动物其他类别的Cry聚为一簇。通过荧光定量PCR技术检测发现生物钟蛋白EsCry在脑中呈节律性表达,在光暗(LD)刺激前48小时内,其mRNA水平的表达都在3:00达到节律表达水平的最低点,在19:00达到节律表达水平的最高点。EsCry能表现出不依赖于光的节律性表达。通过荧光定量PCR技术检测发现EsCry在肝胰腺、眼柄和脑中分布最高,分别为肌肉的100.00倍(p<0.05)、110.00倍(p<0.05)和120.00倍(p<0.05)。免疫荧光亚细胞定位显示,EsCry主要分布在细胞质中。在血细胞中,EsCry的表达在嗜水气单胞菌和脂多糖刺激3小时开始出现显著下调(分为对照组的0.33和0.36倍,p<0.05),在24小时达到最低值(分别为对照组的0.13和0.19倍,p<0.05;在肝胰腺中,EsCry的表达也呈现出被抑制的趋势。在嗜水气单胞菌刺激组,Es Cry2在6小时被显著抑制表达(为对照组的0.04倍,p<0.05),并且这种抑制表达持续至72小时(p<0.05)。在脂多糖实验组,同样也在3小时被显著抑制表达(为对照组的0.38倍,p<0.05),在48小时达到最低点(为对照组的0.02倍,p<0.05),并且这种抑制表达也持续至72小时(p<0.05)。当EsCry被干扰后,EsLITAF和EsILF的表达出现上调(为对照组dsEGFP的1.61倍和2.21倍,p<0.05)。铁硫簇是蛋白质的一种最古老、功能最为重要的辅助因子,它参与催化反应、电子传递、调控代谢过程以及感知周围环境变化等。铁硫簇组装蛋白是铁硫簇组装系统的一个重要的支架蛋白,在铁硫蛋白的组装和成熟过程中发挥着至关重要的作用。研究发现,铁硫簇组装蛋白能调控机体的生物节律,并能与隐花色素蛋白形成二聚体响应外周磁场的变化为鸽子的迁徙定位提供指南针功能。本研究在中华绒螯蟹体内发现了一个铁硫簇组装蛋白2(命名为EsIscA2)。通过基因克隆技术得到了它的开放阅读框为507 bp,编码168个氨基酸。通过蛋白结构域软件分析,它含有一个保守的铁硫组装蛋白结构域。通过SWISSMODEL软件分析预测它能以四聚体的形式存在,并且每一个单体上都含有三个保守的半胱氨酸残基位点(Cys-93,Cys-158,Cys-160),这三个半胱氨酸残基被预测能形成一个“半胱氨酸口袋”。氨基酸序列比对发现EsIscA2与其他物种的IscA的相似性超过50%。系统进化树分析显示EsIscA2既能与无脊椎动物的IscA2聚在一起,也能与脊椎动物的IscA2聚在一起。EsIscA2重组蛋白与铁离子在2-200μM的浓度范围内表现出极高的结合能力。在检测的所有组织中,包括性腺(精巢、卵巢混合物)、血淋巴细胞、鳃、肌肉、心、肝胰腺和眼柄,EsIscA2都有表达。其mRNA水平在肌肉和肝胰腺中表达最多,分别为对照组血淋巴细胞的34.66倍(p<0.05)和27.07倍(p<0.05)。亚细胞定位结果显示EsIscA2蛋白定位在线粒体中。用嗜水气单胞菌和脂多糖刺激中华绒螯蟹后,检测发现EsIscA2的mRNA水平在血淋巴细胞中呈现下调趋势,且分别在24小时和48小时时达到最低水平,分别为对照组的0.31倍(p<0.05)和0.29倍(p<0.05);在肝胰腺中发现从刺激的第6小时至48小时时间段内,EsIscA2的mRNA水平均呈现下调趋势。在体外用双氧水刺激中华绒螯蟹原代细胞15分钟后,EsIscA2的mRNA水平与对照组相比都呈现明显的下调趋势,大约为对照组的0.34-0.44倍。研究还发现用嗜水气单胞菌刺激中华绒螯蟹后,在肝胰腺中谷氧还蛋白2(Grx2)的mRNA水平在3小时开始显著上调(为对照组的3.22倍,p<0.05),并且在12小时达到最高值(为对照组的4.88倍,p<0.05)。上述研究结果表明,EsCry能作为一种生物钟蛋白呈现有节律的表达,调控中华绒螯蟹的生物节律。对中华绒螯蟹进行免疫刺激后,EsCry的表达量下降,干扰EsCry后免疫效应因子EsLITAF和EsILF的表达量上调,这也说明当中华绒螯蟹EsCry表达出现节律紊乱时,会激活免疫系统。EsIscA2蛋白具有较强的铁结合能力,为中华绒螯蟹线粒体铁硫簇的组装提供铁离子。其在免疫和氧化应激刺激后mRNA的特异性表达表明了铁硫簇合成率对外界的应激条件表现出一定的适应性。本研究从基础上验证了中华绒螯蟹体内隐花色素和铁硫簇组装蛋白能作为生物节律蛋白调控生物节律以及免疫应答,为中华绒螯蟹的行为生理学研究和免疫防御研究提供了基本的理论依据。