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柑桔溃疡病（Citrus Bacterial Canker Disease，CBCD）是由地毯草黄单胞杆菌柑桔致病变种（Xanthomonas axonopodis pv. citri, Xac）引起的一种影响全球柑桔产业发展的国内外重大检疫性病害。其主要通过显症或带菌种苗、接穗、果实等柑桔材料的调运进行远距离传播，田间病害主要靠病菌随风夹雨扩散，病菌在自然状态下的存活期较长。对于该病的检疫检验，除传统的方法外，近年来国外己发展了PCR检验技术，但现有技术在特异性和稳定性等方面还存在着一些问题，制样技术亦繁杂费时，并且国内外均无适合实际应用的检测试剂盒研制的报道。我国加入WTO以后，柑桔溃疡病检疫的新形势迫切要求建立一种快速、灵敏、准确的分子诊断和检验技术体系，而国内尚无这方面的研究报道。 研究目的：本研究通过检测稳定性好、灵敏度高的特异性引物的设计与筛选，无害化参照体系的构建，简便快速的浸泡制样技术研究和常温贮藏检测试剂盒的研制，旨在建立起快速准确而又稳定安全的柑桔溃疡病菌PCR检测技术体系，实现大量柑桔样品的快速检验，为柑桔非疫生产区建设和病害预警监测提供一种分子检测技术和实用工具。 研究方法：利用引物和探针设计软件Primer Premier 5.0进行引物的设计；通过扩增靶片段序列在核苷酸序列数据库中进行相似性比对的方法和近缘细菌进行PCR扩增的方法验证了检测的特异性；通过对不同浓度的柑桔溃疡病菌DNA和菌液的PCR扩增测定了检测的灵敏度；通过在不同DNA扩增仪和温度控制方式下的扩增程序调试以及在不同实验室的验证测试保证了检测的稳定性。将靶片段与克隆载体连接后，用CaCl2法转化大肠杆菌（JM109），然后通过测序来验证PCR扩增的正确性；以重组质粒和转化的大肠杆菌构建了无害化参照体系。利用浸泡浓缩法优化了制样技术；采用预混PCR反应液中加入生物活性分子稳定剂并冷冻干燥固相化包被处理的方法研制出能常温贮存的方便有效的检测试剂盒。利用优化的分子检测体系对四川、广西、湖南和重庆等地采集的柑桔样品进行了PCR实际检测，并且部分样品进行了分离培养和致病性测定验证。 研究结果： 1) 基于柑桔溃疡病菌A菌系染色体中的独有保守蛋白基因设计筛选的引物JYF5/JYR5，用于柑桔溃疡病菌的PCR检测具有很高的特异性、灵敏度和稳定性。扩增的靶片段序列在核苷酸序列数据库中相似性比对结果显示：数据库中没有与该对引物配对的序列，与扩增靶片段配对的最长序列也仅42 bp。实际检测表明，柑桔溃疡病菌各菌系均能扩增出靶带，而柑桔叶面腐生菌、柑桔溃疡病菌近缘种以及健康柑桔组织浸提液都扩增不出靶带，显示了该对引物高度的特异性。检测的灵敏度：菌液可达10个靶细菌/25μL，DNA可达1.56 pg/25 μL（25μL为一个反应体积）。PCR扩增条件经优化后，在不同热循环仪和不同的温度控制方式下检测均可得到稳定的结果，但扩增程序有一定的差异。.西南农业大学2004届硕士学位论文一一一一一一一一一一一一一一止1呈一 2)克隆测序结果与己报道的靶序列比对结果显示，二者序列完全一致。这表明PCR扩增产物为预计靶DNA片段，验证了PCR扩增的正确性。由于该菌是重要的检疫性有害生物，不宜以活菌作为检测的阳性对照，而加热灭活的菌液因保存期限短，池不宜作为阳性对照，本研究采用转化的大肠杆菌菌液或重组质粒DNA作为阳性对照，不仅效果理想，而且可以防比检测过程中检疫性有害生物在环境中的扩散。 3)制样技术采用浸泡法，4种浸泡液中，以浸泡液B的浸提效果最好，室温下，最佳浸泡时间为10 min一巧min·浸提液进行加热灭活处理与否，犷CR扩增无明显差异。实际检测中模板的用量对PCR扩增有一定影响。对于无症柑桔样品，浸泡液中加入终浓度为0.3%的NaZSO:可以降低植物色素、多元酚等pCR抑制物质的干扰作用。带菌样品浸提液经过富集和离心处理，不仅可以有效浓缩靶细菌，提高检测灵敏度，而且可以去除柑桔组织咆外的部分PcR抑制物质（植物色素、多元酚、氯原酸以及铜基杀菌剂残留的cuZ+等），明显降低了检测的假阴性。 4)预混pcR反应液中加入适量的生物活性分子稳定剂（MS），具有稳定PCR反应混合液中生物大分子的作用，混合液中MS与HZO的体积比为1:】时其稳定效果最佳。含有MS的预混PCR反应液的几种贮存处理中，以冷冻干燥处理后常温储存贮存的预混PCR反应液的保存期最长，至少可以保存7个月，其它几种贮存处理方式的保存期均不超过1个月。采自四川、广西、湖南和重庆等地的柑桔样品PCR检测结果表明，全部样品的平均阳性检出率为50.67%。部分样品的分离培养和致病性测定结果，基本验证了PCR检测的准确性。检测结果与各地实际病害发生情况吻合。 结论:本研究成功地建立了快速准确而又稳定安全的柑桔溃疡病菌PCR检测技术体系。该技术可以J一‘泛地用于疑症样品鉴定、病害预警监测、出入境检疫以及柑桔非疫生产区建设等方面。