流行病学调查表明,宫内发育迟缓(intrauterine growth retardation, IUGR)胎儿发生成年代谢综合征(metabolic syndrome, MS)的几率是正常胎儿的2.53倍,提示MS存在发育起源。已证实,外源物(如乙醇、尼古丁、咖啡因)是IUGR发生最确切和危险的诱因。我室前期的研究发现,孕期乙醇、尼古丁和咖啡因暴露皆可引起胎儿母源性高糖皮质激素(glucocorticoid, GC)暴露和下丘脑—垂体—肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA)轴功能低下,IUGR子代HPA轴呈现低基础活性和高应激敏感性,并伴有GC依赖性糖脂代谢改变,因此,提出了外源物的“宫内神经内分泌代谢编程机制”。有学者认为,宫内HPA轴的编程改变是成年后MS发生的最可能机制。研究表明,母体GC通过胎盘屏障进入雌性胎儿的量比进入雄性胎儿的量更大,而高水平的GC是程序化影响胎儿HPA轴的主要激素之一,提示了母体应激对雌性后代HPA轴的影响比雄性后代更大。我室前期的研究证实,孕期外源物暴露、生后给予正常饮食和高脂饮食的成年雌鼠仍呈现HPA轴低活性和高应激敏感性,且可引起糖脂代谢改变。那么,在经过孕期外源物暴露、生后长期高脂饮食至成年,调整饮食结构(正常饮食)进入老年期的IUGR雌鼠,此时HPA轴的功能如何?糖脂代谢功能有何改变?代谢性疾病是否更为易感?其机制如何?这些问题至今尚未见相关研究报道。本研究通过建立孕期外源物(乙醇、尼古丁、咖啡因)暴露所致的IUGR大鼠模型,生后4周断奶并给予高脂饮食模拟过营养环境,5.5月龄改为正常饲料喂养直至10月龄。观察慢性应激(14天不可预见性刺激)对老年雌鼠HPA轴功能、糖脂代谢功能及相关脏器组织形态学(如海马、下丘脑、垂体、肾上腺、胰腺、肝脏、肾脏和脂肪)的影响,以期进一步证实IUGR老年雌鼠代谢性疾病易感现象及发生机制,明确孕期外源物暴露给子代带来的影响不仅包括宫内、出生后幼年期和成年期,甚至持续到老年期,从而为这个特殊群体出生后进行及早的、终生的合理生活干预,以预防和减缓代谢相关疾病的发生和发展,提供一定的理论和实验基础。第一部分孕期外源物干预模型老年雌鼠体重和HPA轴结构和功能改变目的：IUGR胎儿出生后HPA轴应激反应增强会加快MS的发展进程。IUGR、追赶性生长及伴随而来的肥胖与后期MS、心血管疾病、2型糖尿病和非酒精性肝病发生密切相关。本课题通过建立孕期多种外源物(乙醇、尼古丁和咖啡因)暴露所致IUGR子代,出生后给予高脂饮食至成年,5.5月龄调整饮食(正常饮食)至10月龄(简称孕期外源物干预模型),观察IUGR老年雌鼠的体重变化、HPA轴功能和多组织形态学改变,探索代谢性疾病易感的发生机制。方法：随机将受孕大鼠分为4组,即对照组、乙醇组、尼古丁组和咖啡因组。于妊娠日(gestional day, GD)11开始,外源物组分别给予乙醇4mg/kg.d(灌胃)、尼古丁2mg/kg.d (皮下注射,分二次给予)和咖啡因120mg/kg.d (灌胃)处理,给药容积为2ml/kg,对照组给予等容量蒸馏水灌胃或生理盐水皮下注射,直至孕鼠自然生产。自然出生后1周开始称体重(因为母鼠分娩后一周内对环境刺激高度敏感),以后每月称量并记录体重。仔鼠于1月时断奶并雌雄分笼,留取雌性仔鼠并开始高脂饲料喂养,5.5月龄改为正常普通饲料喂养,9月龄行口腹葡萄糖耐量实验(oral glucose tolerance tset, OGTT)和行为学检测,并取大鼠尾静脉血,制备血清待检。随后一周开始给予14天不可预见性刺激(简称慢性刺激),然后再行OGTT和行为学检测。实验结束后,异氟烷麻醉处死大鼠,取血制备血清,快速摘取海马、下丘脑、垂体、肾上腺、胰腺、肝脏、肾脏及脂肪,液氮速冻,-80℃保存备用。同时每组随机选取各脏器组织1-2个置于4%多聚甲醛固定用于制作病理切片。RT-PCR检测慢性刺激后海马组织11β-羟基类固醇脱氢酶-1(11β-hydroxysteroid dehydrogenase-1,11β-HSD-1)、糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)和盐皮质激素受体(mineralcorticoid receptor, MR)表达；ELISA方法检测慢性刺激前、后仔鼠血促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophic horone, ACTH)和皮质酮(corticosterone, CORT)浓度。苏木精-伊红(HE)染色观察慢性刺激后多组织形态学改变。结果：①体重变化：乙醇组、尼古丁组和咖啡因组仔鼠出生体重低于对照组(P<0.01),且低于两个标准差,提示IUGR模型成功建立。直至实验结束,乙醇组、尼古丁组和咖啡因组仔鼠体重始终未超过对照组；乙醇组仔鼠于第4个月体重增长明显加快,于第6个月体重增长率高于对照组(P<0.01),尼古丁组仔鼠于第5个月体重增长明显加快,于第7个月体重增长率高于对照组(P<0.01),咖啡因于第5个月出现体重快速增长。提示,孕期外源物干预模型雌鼠在出生后高营养环境下呈现体重“追赶性生长”,且存在外源物差异性；调整饮食后,各组仔鼠体重渐趋稳定,体重增长率曲线渐趋平台期,提示饮食调整可减缓子代大鼠的体重增长。②海马形态学改变及功能：乙醇组、尼古丁组和咖啡因组海马较对照组神经元细胞减少,星形胶质细胞颗粒空泡变性伴局灶性液化坏死；乙醇组、尼古丁组和咖啡因组海马组织11β-HSD-1和GR表达对照组有升高趋势,而MR表达较对照组有降低趋势。③行为学测定：糖水偏好实验、电迷宫实验及旷场实验结果显示,乙醇组、尼古丁组和咖啡因组较对照组均无显著性差异。④HPA轴形态学及功能：从形态学上看,乙醇组、尼古丁组和咖啡因组下丘脑细胞水肿,神经元细胞较对照组不同程度减少,胶质细胞空泡变性伴灶性液化坏死；乙醇组、尼古丁组和咖啡因组垂体较对照组血窦变窄或消失,细胞肿胀、气球样变或空泡变性,乙醇组还可见多灶性液化和纤维化；乙醇组、尼古丁组和咖啡因组肾上腺皮质细胞肿胀,广泛水样变继气球样变,束状带脂肪化生,乙醇组最重,其次是咖啡因组。提示,外源物组下丘脑和垂体均存在不同程度神经元细胞减少及变性坏死,孕期外源物暴露加剧了HPA轴相关组织的损伤。从功能学上看,慢性刺激前,乙醇组和咖啡因组血ACTH水平较对照组有降低趋势,尼古丁组则有升高趋势；乙醇组和尼古丁组血CORT水平较对照组有降低趋势,咖啡因组则有升高趋势。慢性刺激后,乙醇组和咖啡因组血ACTH较对照组升高(P<0.01),尼古丁组则与对照组相当；各外源物血CORT水平较对照组有升高趋势；乙醇组和尼古丁组血CORT水平较慢性刺激前水平有升高(P<0.01,P<0.05),而咖啡因组不明显。提示外源物组老年雌鼠HPA轴高应激敏感性。结论：孕期外源物暴露所致IUGR仔鼠在出生后营养状态好的情况下,呈现体重追赶性生长,调整饮食可使其体重增长减缓；孕期外源物暴露加剧高脂饮食所致HPA轴相关组织及海马的结构与功能损伤,进入老年期的IUGR雌鼠HPA轴仍存在高应激敏感性,然而海马相关行为学无明显改变。第二部分孕期外源物干预模型老年雌鼠代谢相关组织结构与糖脂代谢功能改变目的：流行病学调查提示,IUGR胎儿成年后发生糖代谢减低和胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)的几率增加。血脂异常可引起或加重IR和影响胰岛p细胞功能,同时IR和胰岛素分泌不足又可进一步加重脂质代谢紊乱,从而引起一系列的代谢紊乱及相关疾病,如2型糖尿病、脂肪肝、心脑血管疾病等。本研究通过观察孕期外源物干预模型的老年雌鼠代谢相关组织形态学改变和慢性刺激前、后糖脂代谢功能的变化,进一步明确孕期外源物暴露所致HPA轴编程是否影响IUGR老年雌鼠外周糖脂代谢并由此造成代谢性疾病易感的可能机制。方法：留取标本方法同第一部分。葡萄糖氧化酶法检测慢性刺激前、后OGTT中各时间点血糖水平,放射免疫法检测慢性刺激前、后血胰岛素水平,甘油-3-磷酸氧化酶法检测慢性刺激前后血甘油三酯(triglyceride, TG)水平,胆固醇氧化酶法检测慢性刺激前、后血总胆固醇(total cholesterol, TCH)水平,选择性沉淀法检测慢性刺激前、后血高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C),选择性沉淀法检测慢性刺激前、后血低密度脂蛋白-胆固醇(low density lipoprotein-cholesterol, LDL-C)。4%多聚甲醛固定胰腺、肝脏、肾脏及脂肪用于制作病理切片,HE染色观察其形态学变化。结果：(1)糖代谢：①基础血糖和胰岛素：慢性刺激前,乙醇组和尼古丁组基础血糖和胰岛素水平与对照组相当,乙醇组和尼古丁组胰岛素抵抗指数(insulin resistance index, IRI)与对照组无显著性差别；然而,咖啡因组基础血糖较对照组有升高趋势,血胰岛素水平较对照组显著升高(P<0.01),咖啡因组IRI明显高于对照组,提示咖啡因组胰岛素释放增加。慢性刺激后,乙醇组、尼古丁组和咖啡因组血糖较对照组有升高趋势,血胰岛素水平较对照组显著降低(P<0.01),提示IUGR老年雌鼠胰腺释放胰岛素功能明显减退,外源物组IRI随之降低。②OGTT结果显示,慢性刺激前,乙醇组的血糖最高点后移至60min处,但在120min时回到0点血糖水平。慢性刺激后,乙醇组血糖曲线图与慢性刺激前相似,在120min时未能回到0min血糖水平。提示,慢性刺激前乙醇组IUGR老年雌鼠清除糖负荷的能力减退,最终尚能将堆积的血糖清除；慢性刺激后乙醇组IUGR老年雌鼠的糖代谢能力进一步减弱,糖耐量减退。尼古丁组及咖啡因组血糖代谢改变不及乙醇组典型。慢性刺激前、后乙醇组、尼古丁组和咖啡因组血糖AUC相对值与对照组相比无显著性差异。(2)脂代谢。①血脂：慢性刺激前,乙醇组、尼古丁组和咖啡因组血TG、TCH水平较对照组无显著性差异,乙醇组血LDL-C水平较对照组有显著升高(P<0.01),尼古丁组和咖啡因组血LDL-C水平较对照组有升高趋势,乙醇组和尼古丁组血HDL-C水平较对照组显著降低(P<0.01),咖啡因组有降低趋势。慢性刺激后,乙醇组、尼古丁组和咖啡因组血TG水平均较慢性刺激前显著性升高(P<0.01),乙醇组和尼古丁组较对照组显著性升高(P<0.05),咖啡因组有升高趋势；乙醇组和咖啡因组血TCH水平较对照组显著性升高(P<0.01,P<0.05),尼古丁组除外；乙醇组血LDL-C水平较对照组显著性增加(P<0.05)；尼古丁组血HDL-C水平较较对照组显著性降低,咖啡因组血HDL-C水平较慢性刺激前显著性降低(P<0.01)。提示,孕期外源物暴露加剧了高脂饮食所致的脂代谢紊乱,饮食调整可在一定程度减轻脂代谢紊乱,且不同外源物之间存在差异。②血脂比值：慢性刺激前、后,乙醇组和尼古丁组LDL-C/HDL-C和TCH/HDL-C比值较对照组显著升高(P<0.01,P<0.05),慢性刺激前,乙醇组、尼古丁组和咖啡因组TG/HDL-C比值与对照组相当,慢性刺激后乙醇组和和尼古丁组TG/HDL-C比值较对照组显著性升高(P<0.05),慢性刺激前后咖啡因组血脂比值与对照组相当。(3)组织形态学：乙醇组、尼古丁组和咖啡因组胰腺组织均表现为不同程度的胰岛减少或消失,腺泡肿胀,脂滴沉积,乙醇组还可见胰腺广泛液化坏死,提示孕期外源物暴露可加剧高脂饮食所致的胰腺损伤。乙醇组、尼古丁组和咖啡因组肝细胞弥漫性水样变、气球样变及不同程度的脂肪变和肝细胞坏死,尤其是乙醇组,汇管区还可见炎性细胞浸润和kupffer细胞增生；乙醇组、尼古丁组和咖啡因组肾小球内皮细胞肿胀,肾小管上皮细胞肿胀,空泡变性,部分崩解脱落。乙醇组、尼古丁组和咖啡因组脂肪组织细胞增生,大小不一,细胞壁不完整,部分融合呈大细胞,乙醇组最为显著。提示,孕期外源物暴露加剧高脂饮食所致的代谢相关组织损伤。结论：孕期外源物干预模型老年雌鼠出现明显的糖脂代谢功能受损、外周相关组织(胰腺、肝脏、肾脏和脂肪)结构损害和脂质沉积；结合本室前期工作,我们提出,成年后的饮食调整在一定程度上虽可减轻孕期外源物干预模型老年雌鼠脂代谢紊乱和相关组织脂质沉积,但孕期外源物暴露可加剧胰岛素释放和糖代谢功能的异常；孕期外源物暴露致HPA轴高应激敏感性的编程改变可增加IUGR老年雌鼠代谢性疾病易感。