CRISPR-Cas是原核生物中一种可编程的具有免疫记忆的适应性(获得性)免疫系统,外源基因以间隔序列的形式存储并插入到CRISPR阵列中,然后通过RNA引导的核酸酶效应物来介导破坏任何入侵的移动遗传元件DNA。CRISPR-Cas系统根据蛋白效应物的不同分成两个类别,第1类为多亚基效应复合物,而2类为单一蛋白效应物。基于不同的效应蛋白家族,第2类系统又分为Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ三类和九个亚型。其中Ⅱ型CRISPR效应核酸酶Cas9和V型Cpf1是“通用”DNA核酸内切酶,其通过适当的crRNA或sgRNA链以在预选位置切割几乎任何DNA双链体(仅由短的PAM限制)来进行编程。因此,CRISPR-Cas系统不仅可以被用作病毒防御机制,也可以用于减少流动性遗传因子的传播。该免疫系统在过去几年已经变成了强大的基因组编辑工具和极大地成为了广泛生物体的分子工具箱。Cpf1是CRISPR-Cas RNA可编程内切核酸酶的新型2类家族,也称为Cas12a,具有缺乏tracrRNA的单一RNA引导的核酸内切酶独特的特征,利用富含T的PAM识别并切割与crRNA指导互补且远离PAM的双链DNA靶标,产生交错的DNA双链,即突出5nt的粘性末端。本研究是以可编程内切核酸酶Cpf1可对基因进行编辑为背景,利用的Cpf1是来源于Francisellatularensisnovicida的U112菌株(FnCpf1),其基因序列号:MF193599,基因编码序列长为3903 bp,编码1301个氨基酸。我们成功构建了融合MBP标签的FnCpf1酶的异源表达质粒,实现了其在E.coliBL21(DE3)表达系统中的高效可溶性表达和较高酶切活性。另外我们不仅体外成功转录出单链引导RNA,建立了一套FnCpf1高效酶切体系,还通过一系列地大胆设想和实验探索成功完成了仅由单条sgRNA介导的可编程酶CRISPR-FnCpf1可作为人工限制性内切酶使目标片段在质粒间的转移和多基因装配的应用。相比较于传统的二型限制性内切酶该方法有更多的优势,如突出的粘性末端更长,无需受目标片段内部酶切位点和序列本身的限制,可充当多种限制性内切酶的作用,成本低,操作简单等,使其成为用于基因组工程的非常有吸引力的替代或补充。近些年来从小片段DNA组装成大型构建体是有非常重要意义的,成为推动合成生物学领域发展的关键技术。虽然现有的基因装配方法种类繁多,但是各自都具有不同的适用性和局限性,通常是实行几项技术联合使用的策略。本研究建立的一种由可编程核酸内切酶CRISPR/Cpf1介导的体外DNA组装的新方法,可作为对传统的基因克隆装配方法的有力补充。利用FnCpf1酶切成功完成了目标片段在质粒间的转移等实验;接着,本实验还开创性地提出“简并sgRNA”的构想并完成可行性验证,发现简并sgRNA引导FnCpf1也可以对靶DNA进行限制性酶切;最后,我们又大胆地提出利用末端6nt与靶DNA对应区域不匹配sgRNA来引导FnCpf1酶切,幸运地发现末端6nt不匹配sgRNA引导的FnCpf1同样有明显的酶切效果。该方法具有巨大的优越性,其可以容易地用于代替常规用于分子克隆的限制酶,还让体外无缝装配变得更简洁。更重要的是仅由单条sgRNA引导的异源表达可编程酶FnCpf1与T5核酸核酸外切酶连用可大大地提高多片段装配的效率。